Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රවුසර අනුවාදයට සීමිත CSS සහය ඇත.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය ලබා දෙන්නෙමු.
සක්‍රිය එස්ටර හෝ ෆීනොක්සි රැඩිකල් මත පදනම් වූ එන්සයිම සමීප ලේබල් කිරීමේ ක්‍රම සජීවී සෛලවල උප සෛල ප්‍රෝටියෝම් සහ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්රියා සිතියම්ගත කිරීම සඳහා බහුලව භාවිතා වේ.කෙසේ වෙතත්, සක්‍රිය එස්ටර අඩු ප්‍රතික්‍රියාශීලී වන අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස පුළුල් ලේබල් කිරීමේ අරයක් ඇති වන අතර, පෙරොක්සයිඩ් ප්‍රතිකාරය මගින් ජනනය කරන ෆීනොක්සි රැඩිකලුන් රෙඩොක්ස් මාර්ගවලට බාධා කළ හැකිය.මෙහිදී අපි miniSOG ෆොටෝසෙන්සිටයිසර් ප්‍රෝටීනය උනන්දුවක් දක්වන ප්‍රෝටීනයකට ජානමය වශයෙන් සම්බන්ධ කිරීමෙන් සංවර්ධනය කරන ලද සමීප ලේබල් කිරීමේ යැපුම් ඡායාරූප සක්‍රීය කිරීමේ (PDPL) ක්‍රමයක් වාර්තා කරන්නෙමු.නිල් ආලෝකය මගින් ක්‍රියා විරහිත කර නිරාවරණ කාලය මගින් පාලනය කරනු ලබන අතර, තනි ඔක්සිජන් ජනනය වන අතර, ඇනිලීන් පරීක්ෂණය මගින් හිස්ටයිඩින් අවශේෂවල අවකාශීය ලෙස විසඳන ලද ලේබල් කිරීම සාක්ෂාත් කරගනු ලැබේ.ඉන්ද්‍රිය-විශේෂිත ප්‍රෝටියෝම් සිතියම්කරණය හරහා අපි එහි ඉහළ විශ්වාසවන්තභාවය ප්‍රදර්ශනය කරමු.PDPL සහ TurboID සමඟ සංසන්දනය කිරීම PDPL හි වඩාත් නිශ්චිත සහ විස්තීර්ණ ප්‍රෝටෝමික් ආවරණයක් පෙන්වයි.මීළඟට, අපි PDPL රෝගය ආශ්‍රිත පිටපත් කිරීමේ කෝක්ටිවේටරය BRD4 සහ E3 Parkin ligase වෙත යෙදූ අතර කලින් නොදන්නා අන්තර්ක්‍රියාකාරීන් සොයා ගත්තෙමු.අධි ප්‍රකාශන පිරික්සීම මගින්, පාර්කින් සඳහා නොදන්නා උපස්ථර දෙකක්, Ssu72 සහ SNW1 හඳුනාගෙන ඇති අතර, එහි ක්ෂය වීම සර්වප්‍රකාර-ප්‍රෝටීසෝම මාර්ගය මගින් මැදිහත් වේ.
ප්‍රෝටීන් ජාල වල නිරවද්‍ය ගුනාංගීකරනය බොහෝ මූලික සෛලීය ක්‍රියාවලි වලට යටින් පවතී.එබැවින්, ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියාවල ඉතා නිවැරදි අවකාශීය සිතියම්ගත කිරීම ජීව විද්‍යාත්මක මාර්ග, රෝග ව්‍යාධි විද්යාව විකේතනය කිරීම සහ චිකිත්සක අරමුණු සඳහා මෙම අන්තර්ක්රියා කඩාකප්පල් කිරීම සඳහා අණුක පදනමක් සපයනු ඇත.මේ සඳහා සජීවී සෛල හෝ පටකවල තාවකාලික අන්තර්ක්රියා හඳුනාගැනීමේ හැකියාව ඇති ක්‍රම ඉතා යෝග්‍ය වේ.ආසක්ත පවිත්‍ර කිරීමේ ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (AP-MS) ඓතිහාසිකව උනන්දුව ඇති ප්‍රෝටීන වල (POIs) බන්ධන හවුල්කරුවන් හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කර ඇත.ප්‍රමාණාත්මක ප්‍රෝටෝමික්ස් ක්‍රම දියුණු කිරීමත් සමඟ, AP-MS මත පදනම් වූ ප්‍රෝටීන් ජාල වල විශාලතම දත්ත සමුදාය වන Bioplex3.0 නිර්මාණය කරන ලදී.AP-MS ඉතා ප්‍රබල වුවද, වැඩ ප්‍රවාහයේ සෛල ඛාදනය සහ තනුක කිරීමේ පියවර දුර්වල සහ අස්ථිර බන්ධන අන්තර්ක්රියා වලට පක්ෂග්‍රාහී වන අතර ලයිසිස් වලට පෙර කොටස්කරණයක් නොමැති ව්‍යාජ අන්තර්ක්රියා යුගල වැනි පශ්චාත්-ලිසිස් කෞතුක වස්තු හඳුන්වා දෙයි.
මෙම ගැටළු විසඳීම සඳහා, හරස් සම්බන්ධක කණ්ඩායම් සහිත අස්වාභාවික ඇමයිනෝ අම්ල (UAA) සහ එන්සයිම අසල ලේබල් කිරීමේ (PL) වේදිකා (උදා: APEX සහ BioID)5 සංවර්ධනය කර ඇත.UAA ක්‍රමය බොහෝ අවස්ථාවන්හිදී සාර්ථකව යෙදී ඇති අතර සෘජු ප්‍රෝටීන් ඇලවුම් පිළිබඳ තොරතුරු සපයන නමුත්, UAA ඇතුළත් කිරීමේ අඩවිය ප්‍රශස්ත කිරීම තවමත් අවශ්‍ය වේ.වඩාත් වැදගත් වන්නේ, එය ලේබල් කිරීමේ සිදුවීම් උත්ප්‍රේරක ප්‍රතිවර්තනයක් නොමැති ස්ටෝචියෝමිතික ලේබල් කිරීමේ ක්‍රමයකි.ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, BioID ක්‍රමය වැනි එන්සයිම PL ක්‍රම, ඉන්ජිනේරු කරන ලද biotin ligase POI7 වෙත විලයනය කරයි, එය පසුව biotin සක්‍රීය කර ප්‍රතික්‍රියාශීලී biotinyl-AMP එස්ටර අතරමැදියක් සාදයි.එන්සයිමය මෙලෙස උත්ප්‍රේරණය කර සක්‍රීය බයෝටින් “වලාකුළක්” මුදාහරින අතර එය සමීප ලයිසීන් අපද්‍රව්‍ය ලේබල් කරයි.කෙසේ වෙතත්, BioID හට ප්‍රමාණවත් ලේබල් සංඥාවක් ලබා ගැනීමට පැය 12කට වඩා වැඩි කාලයක් අවශ්‍ය වේ, එය තාවකාලික විභේදනය සමඟ එහි භාවිතය වළක්වයි.යීස්ට් සංදර්ශකය මත පදනම් වූ අධ්‍යක්ෂණය කරන ලද පරිණාමය භාවිතා කරමින්, TurboID නිර්මාණය කර ඇත්තේ BioID මත පදනම්ව වඩා කාර්යක්ෂම වන අතර, මිනිත්තු 10 ක් ඇතුළත biotin සමඟ කාර්යක්ෂම ලේබල් කිරීමට ඉඩ සලසමින්, වඩාත් ගතික ක්රියාවලීන් අධ්‍යයනය කිරීමට ඉඩ සලසයි.TurboID ඉතා සක්‍රීය වන අතර පහත් මට්ටමේ ලේබල් කිරීම සඳහා අන්තරාසර්ග බයෝටින් මට්ටම් ප්‍රමාණවත් බැවින්, බාහිර බයෝටින් එකතු කිරීම මගින් අතිශයින් වැඩි දියුණු කළ සහ කාලානුරූපී ලේබල් කිරීම අවශ්‍ය වූ විට පසුබිම් ලේබල් කිරීම විභව ගැටලුවක් බවට පත්වේ.ඊට අමතරව, සක්‍රිය එස්ටර දුර්වල ලෙස ප්‍රතික්‍රියාශීලී වේ (t1/2 ~5 min), එය විශාල ලේබල් කිරීමේ අරයක් ඇති කළ හැකිය, විශේෂයෙන් අසල්වැසි ප්‍රෝටීන biotin 5 සමඟ සංතෘප්ත වීමෙන් පසුව. තවත් ප්‍රවේශයකින්, ඉංජිනේරු ඇස්කෝර්බේට් පෙරොක්සිඩේස් (එනම් biotin- phenol radicals සහ විනාඩියක් ඇතුළත ප්‍රෝටීන් ලේබල් කිරීමට ඉඩ දෙයි සෛලීය ක්රියාවලීන්.
මේ අනුව, සෛලීය මාර්ග සැලකිය යුතු ලෙස කඩාකප්පල් නොකර ඉහළ අවකාශීය සහ තාවකාලික නිරවද්‍යතාවයකින් වඩාත් ප්‍රතික්‍රියාශීලී ලේබල් කරන ලද අරය මර්දන විශේෂයන් ජනනය කළ හැකි නව ක්‍රමයක් පවතින ක්‍රමවලට වැදගත් එකතු කිරීමක් වනු ඇත. ප්‍රතික්‍රියාශීලී විශේෂ අතර, තනි ඔක්සිජන් එහි කෙටි ආයු කාලය සහ සීමිත විසරණ අරය (සෛලවල t1/2 <0.6 µs) හේතුවෙන් අපගේ අවධානයට ලක් විය. ප්‍රතික්‍රියාශීලී විශේෂ අතර, තනි ඔක්සිජන් එහි කෙටි ආයු කාලය සහ සීමිත විසරණ අරය (සෛලවල t1/2 <0.6 µs) හේතුවෙන් අපගේ අවධානයට ලක් විය. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. ක්‍රියාකාරී ආකාර අතරින්, තනි ඔක්සිජන් එහි කෙටි ආයු කාලය සහ සීමිත විසරණ අරය (සෛලවල t1/2 <0.6 µs) හේතුවෙන් අපගේ අවධානයට ලක් විය.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限㼈细胞中t1/2 <0.6 µs 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). සක්‍රීය ආකාර අතර, තනි ඔක්සිජන් අපගේ අවධානය ආකර්ෂණය වන්නේ එහි කෙටි ආයු කාලය සහ සීමිත විසරණ අරය (සෛලවල t1/2 <0.6 μs) නිසාය.තනි ඔක්සිජන් අහඹු ලෙස මෙතියොනීන්, ටයිරොසීන්, හිස්ටයිඩින් සහ ට්‍රිප්ටෝෆාන් ඔක්සිකරණය කරන බවට වාර්තා වී ඇති අතර, එය ඇමයින් හෝ තයෝල් මත පදනම් වූ ප්‍රොබ්ස් වෙත ඇමිණීම සඳහා ධ්‍රැවීය 14,15 බවට පත් කරයි.උප සෛලීය මැදිරිය RNA ලේබල් කිරීම සඳහා තනි ඔක්සිජන් භාවිතා කර ඇතත්, ආවේණික POI සමීපතා සලකුණු නැවත සකස් කිරීමේ උපාය මාර්ග ගවේෂණය කර නොමැත.මෙහිදී, අපි photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL) නමින් වේදිකාවක් ඉදිරිපත් කරන්නෙමු, එහිදී අපි miniSOG ෆොටෝසෙන්සිටයිසර් සමඟ ඒකාබද්ධ කර ඇති POI ආලෝකමත් කිරීමට සහ සමීප අපද්‍රව්‍ය ඔක්සිකරණය කිරීමට තනි ඔක්සිජන් උත්පාදනය ප්‍රේරණය කිරීමට නිල් ආලෝකය භාවිතා කරන අතර, පසුව රසායනික පරීක්ෂණ ඔක්සිකරණය කිරීම සඳහා ඇමයින් අඩංගු වෙනස් කිරීම් සිදු කරයි. අතරමැදි ජීව සෛල..අපි ටැග් විශේෂත්වය උපරිම කිරීම සඳහා රසායනික පරීක්ෂණ සමූහයක් පරීක්ෂා කළ අතර විවෘත ප්‍රෝටෝමික්ස් කාර්ය ප්‍රවාහයක් භාවිතයෙන් වෙනස් කිරීමේ අඩවි හඳුනා ගත්තෙමු.PDPL සහ TurboID සමඟ සංසන්දනය කිරීම PDPL හි වඩාත් නිශ්චිත සහ විස්තීර්ණ ප්‍රෝටෝමික් ආවරණයක් පෙන්වයි.අපි මෙම ප්‍රවේශය පිළිකා ආශ්‍රිත එපිජෙනටික් නියාමන ප්‍රෝටීන් BRD4 සහ පාකින්සන් රෝගය ආශ්‍රිත E3 ligase Parkin සඳහා උප සෛලීය ප්‍රෝටියෝමයේ සහ බන්ධන හවුල්කරුවන්ගේ සාමාන්‍ය ප්‍රෝටියෝමය හඳුනාගැනීමේ ඉන්ද්‍රිය-විශේෂිත සලකුණු සඳහා යොදා ගත්තෙමු. අන්තර්ක්රියා..විශාල ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණවල E3 උපස්ථර හඳුනා ගැනීමට PDPL හි ඇති හැකියාව වක්ර බන්ධක හඳුනාගැනීම අවශ්‍ය වන තත්වයක් නියෝජනය කරයි.ubiquitination-proteasome මගින් මැදිහත් වූ නොදන්නා පාකින් උපස්ථර දෙකක් ස්ථානගතව තහවුරු කර ඇත.
ප්‍රභාගතික චිකිත්සාව (PDT)19 සහ වර්ණදේහ ආධාරයෙන් ලේසර් අක්‍රිය කිරීම (CALI)20, ප්‍රභාසංවේදක සමඟ ආලෝක ප්‍රකිරණය තනි ඔක්සිජන් ජනනය කරයි, ඉලක්කගත ප්‍රෝටීන අක්‍රිය කිරීමට හෝ සෛල මරණයට හේතු විය හැක.තනි ඔක්සිජන් යනු න්‍යායාත්මක විසරණ දුර 70 nm පමණ වන ඉතා ප්‍රතික්‍රියාශීලී ද්‍රව්‍යයක් වන බැවින්, ප්‍රභාසංවේදකය වටා අවකාශීය වශයෙන් සීමිත ඔක්සිකරණය පාලනය කළ හැක.මෙම සංකල්පය මත පදනම්ව, සජීවී සෛලවල ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණවල සමීප ලේබල් කිරීම සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා තනි ඔක්සිජන් භාවිතා කිරීමට අපි තීරණය කළෙමු.අපි කාර්යයන් හතරක් ඉටු කිරීම සඳහා PDPL රසායනික ප්‍රොටේමික් ප්‍රවේශයක් සකස් කර ඇත: (1) PL එන්සයිම ප්‍රවේශයට සමාන සක්‍රීය තනි ඔක්සිජන් උත්පාදනය උත්ප්‍රේරණය කිරීමට;(2) ආලෝකය ආරම්භය මත කාලය විසඳන ලේබල් සැපයීම;(3) වෙනස් කිරීම මගින් (4) පසුබිම අඩු කිරීම සඳහා අන්තරාසර්ග කෝෆැක්ටර් (බයෝටින් වැනි) භාවිතා කිරීමෙන් වළකින්න, නැතහොත් පාරිසරික ආතතියට සෛල නිරාවරණය වීම අවම කිරීම සඳහා අධික කැළඹිලි සහිත බාහිර ප්‍රතික්‍රියාකාරක (පෙරොක්සයිඩ් වැනි) භාවිතා කිරීමෙන් වළකින්න.
කුඩා අණුක බර ෆ්ලෝරෝෆෝර (උදා: රෝස බෙංගාලය, මෙතිලීන් නිල්) 22 සහ ජානමය වශයෙන් කේතනය කරන ලද කුඩා ප්‍රෝටීන (උදා: miniSOG, KillerRed) 23 ඇතුළුව ප්‍රභාසංවේදක කාණ්ඩ දෙකකට බෙදිය හැකිය.මොඩියුලර් සැලසුමක් සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා, අපි POI24,25 (Figure 1a) වෙත ප්‍රභාසංවේදක (PS) ප්‍රෝටීන එකතු කිරීමෙන් පළමු පරම්පරාවේ PDPL වේදිකාව සංවර්ධනය කළෙමු.නිල් ආලෝකයෙන් ප්‍රකිරණය වූ විට, සිංගල්ට් ඔක්සිජන් ප්‍රොක්සිමල් නියුක්ලියෝෆිලික් ඇමයිනෝ අම්ල අපද්‍රව්‍ය ඔක්සිකරණය කරයි, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස umpolung ධ්‍රැවීයතාවක් ඇති වන අතර එය ඉලෙක්ට්‍රොෆිලික් වන අතර ඇමයින් ප්‍රොබ් නියුක්ලියෝෆයිල්ස් සමඟ තවදුරටත් ප්‍රතික්‍රියා කළ හැකිය.පරීක්ෂණ රසායන විද්යාව ක්ලික් කිරීමට සහ LC/MS/MS ගුනාංගීකරනය සඳහා පහළට ඇදීමට ඉඩ සලසන ඇල්කයින හසුරුවකින් නිර්මාණය කර ඇත.
miniSOG මගින් මැදිහත් වන ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ ලේබල් කිරීමේ ක්‍රමානුකූල නිදර්ශනය.නිල් ආලෝකයට නිරාවරණය වන විට, miniSOG-POI ප්‍රකාශ කරන සෛල තනි ඔක්සිජන් ජනනය කරයි, එය අන්තර්ක්රියා කරන ප්‍රෝටීන වෙනස් කරන නමුත් බන්ධන නොවන ප්‍රෝටීන නොවේ.ප්‍රකාශ ඔක්සිකරණයේ අතරමැදි නිෂ්පාදන සහසංයුජ ආකලන සෑදීම සඳහා ඇමයින් රසායනික පරීක්ෂණයේ රිලේ ලේබල් මගින් බාධා කරනු ලැබේ.රසායන විද්‍යා පරීක්ෂණයේ ඇති ඇල්කයිනයිල් කාණ්ඩය, LC-MS/MS ප්‍රමාණකරණය මගින් පහතට ඇද දැමීමෙන් පොහොසත් කිරීම සඳහා ක්ලික් රසායනයට ඉඩ ලබා දේ.b ඇමයින් පරීක්ෂණවල රසායනික ව්යුහය 1-4.c මයිටොකොන්ඩ්‍රිය දේශීයකරණය කරන ලද miniSOG-මැදිහත් වූ ප්‍රෝටෝමික් සලකුණු වල නියෝජිත ප්‍රතිදීප්ත ජෙල් විශ්ලේෂණය 1-4 පරීක්ෂණ සහ ජෙල් ඩෙන්සිටෝමිතිය මත පදනම් වූ සාපේක්ෂ ප්‍රමාණකරණය.රසායනික පිරික්සුම්වල සංඥා-පසුබිම් අනුපාතය නිල් ආලෝකය හැර සෘණ පාලන අත්හදා බැලීම් භාවිතයෙන් හෝ miniSOG ප්‍රකාශනයකින් තොරව HEK293T සෛල භාවිතයෙන් තක්සේරු කරන ලදී.n = 2 ජීව විද්‍යාත්මකව ස්වාධීන සාම්පල.සෑම තිතක්ම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක් නියෝජනය කරයි.d c වැනි සඳහන් PDPL සංරචක පවතින විට හෝ නොමැති විට ප්‍රශස්ත ගවේෂණ 3 භාවිතා කරමින් PDPL හි නියෝජිත හඳුනා ගැනීම සහ ප්‍රමාණ කිරීම.n = 3 ජීව විද්‍යාත්මකව ස්වාධීන සාම්පල.සෑම තිතක්ම ජීව විද්‍යාත්මක අනුරුවක් නියෝජනය කරයි.මධ්‍ය රේඛා සහ උඩු රැවුල සාමාන්‍ය සහ ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.CBB: Coomassie Brilliant Blue.ඊ ඈත-රතු Si-DMA පැල්ලමක් සහිත තනි ඔක්සිජන් වල සංවෘත රූප.පරිමාණ තීරුව: 10 µm.ජෙල් ඉමේජින් සහ කන්ෆෝකල් අත්හදා බැලීම් සමාන ප්රතිඵල සමඟ අවම වශයෙන් දෙවරක්වත් ස්වාධීනව පුනරාවර්තනය විය.
ප්‍රෝටියෝමයේ ප්‍රොපර්ගිලමයින් ලේබල් කිරීම රසායනික පරීක්ෂණයක් ලෙස මැදිහත් වීමට HEK293T හි ස්ථායීව ප්‍රකාශිත පරිණත ප්‍රභාසංවේදක miniSOG26 සහ KillerRed23 හි හැකියාව අපි පළමුව පරීක්ෂා කළෙමු (පරිපූරක Fig. 1a).Gel fluorescence විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ miniSOG සහ නිල් ආලෝක ප්‍රකිරණය භාවිතයෙන් සම්පූර්ණ ප්‍රෝටියෝම ලේබල් කිරීම සිදු කර ඇති අතර KillerRed සමඟ දෘශ්‍ය ලේබල් කිරීමේ නිෂ්පාදනයක් නිරීක්ෂණය නොවූ බවයි.සංඥා-පසුබිම් අනුපාතය වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා, අපි පසුව aniline (1 සහ 3), propylamine (2) හෝ benzylamine (4) අඩංගු රසායනික පරීක්ෂණ කට්ටලයක් පරීක්ෂා කළා.HEK293T සෛල නිල් ආලෝකයට සාපේක්ෂව ඉහළ පසුබිම් සංඥාවක් ඇති බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු, සමහර විට අන්තරාසර්ග රයිබොෆ්ලැවින් ෆොටෝසෙන්සිටයිසර්, ෆ්ලේවින් මොනොනියුක්ලියෝටයිඩ (FMN) 27 නිසා විය හැකිය. ඇනිලීන් මත පදනම් වූ රසායනික පරීක්ෂණ 1 සහ 3 වඩා හොඳ නිශ්චිතතාවයක් ලබා දුන් අතර, මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවේ miniSOG ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරමින් HEK293T මඟින් පරීක්ෂණ 3 සඳහා සංඥා 8-ගුණයක වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කරන අතර, RNA-ලේබල් කිරීමේ ක්‍රමයේ CAP-seq හි භාවිතා කරන ලද probe 2 ~2.5- පමණක් පෙන්වයි. RNA සහ ප්‍රෝටීන් අතර විවිධ ප්‍රතික්‍රියාකාරක මනාපයන් නිසා ගුණිත සංඥා වැඩි වීම (රූපය 1b, c). ඇනිලීන් මත පදනම් වූ රසායනික පරීක්ෂණ 1 සහ 3 වඩා හොඳ නිශ්චිතතාවයක් ලබා දුන් අතර, මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවේ miniSOG ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරමින් HEK293T මඟින් පරීක්ෂණ 3 සඳහා සංඥා 8-ගුණයක වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කරන අතර, RNA-ලේබල් කිරීමේ ක්‍රමයේ CAP-seq හි භාවිතා කරන ලද probe 2 ~2.5- පමණක් පෙන්වයි. RNA සහ ප්‍රෝටීන් අතර විවිධ ප්‍රතික්‍රියාකාරක මනාපයන් නිසා ගුණිත සංඥා වැඩි වීම (රූපය 1b, c).ඇනිලීන් මත පදනම් වූ රසායනික පරීක්ෂණ 1 සහ 3 වඩා හොඳ විශේෂත්වයක් පෙන්නුම් කළේය: මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවේ miniSOG ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරන HEK293T, පරීක්ෂණ 3 සඳහා සංඥාවේ 8 ගුණයකට වඩා වැඩි වීමක් පෙන්නුම් කරන අතර, පරීක්ෂණ 2, CAP-seq RNA ලේබල් කිරීමේ ක්‍රමයේදී පමණක් භාවිතා කරයි. RNA සහ ප්‍රෝටීන් අතර විවිධ ප්‍රතික්‍රියා මනාපයන් නිසා ~2.5-ගුණයක සංඥා වැඩිවීමක් පෙන්වයි (රූපය 1b, c).基于基于2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）。基于 苯胺 化学 化学 化学 1 探针 具有 3 更 3, HK293T 在-倍信号增加，可能是由于RNAඇනිලීන් මත පදනම් වූ රසායනික පරීක්ෂණ 1 සහ 3 වඩා හොඳ නිශ්චිතතාවයක් ඇති අතර, HEK293T මයිටොකොන්ඩ්‍රියාවේ miniSOG ස්ථායීව ප්‍රකාශ කර ඇති අතර, පරීක්ෂණ 3 හි සංඥාව 8 ගුණයකින් වැඩි වී ඇති අතර, CAP-seq RNA ලේබල් කිරීමේ ක්‍රමය සඳහා පරීක්ෂණ 2 පෙන්නුම් කළේ ~2.5 ගුණයක වැඩිවීමක් පමණි.සංඥාව තුළ, RNA සහ ප්‍රෝටීන් අතර විවිධ ප්‍රතික්‍රියා මනාපයන් නිසා විය හැකිය (රූපය 1b, c).මීට අමතරව, probe 3 සමාවයවික සහ හයිඩ්‍රසීන් පරීක්ෂණ (පරීක්ෂණ 5, 6, 7) පරීක්ෂා කරන ලද අතර, පරීක්ෂණ 3 හි ප්‍රශස්තිකරණය තහවුරු කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 1b,c).ඒ හා සමානව, ජෙල් ප්‍රතිදීප්ත විශ්ලේෂණ මගින් අනෙකුත් ප්‍රශස්ත පර්යේෂණාත්මක පරාමිතීන් අනාවරණය කර ඇත: විකිරණ තරංග ආයාමය (460 nm), රසායනික පරීක්ෂණ සාන්ද්‍රණය (1 mM), සහ ප්‍රකිරණ කාලය (මිනිත්තු 20) (පරිපූරක Fig. 2a-c).PDPL ප්‍රොටෝකෝලයෙහි කිසියම් සංරචකයක් හෝ පියවරක් මඟ හැරීමෙන් පසුබිමට සැලකිය යුතු සංඥා ප්‍රතිවර්තනයක් සිදු විය (රූපය 1d).සිංගල්ට් ඔක්සිජන් නිවාදැමීමට දන්නා සෝඩියම් ඇසයිඩ් හෝ ට්‍රොලොක්ස් හමුවේ ප්‍රෝටීන් ලේබල් කිරීම සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇත.තනි ඔක්සිජන් ස්ථායීකරණය කිරීමට දන්නා D2O තිබීම ලේබල් කිරීමේ සංඥාව වැඩි දියුණු කරයි.ලේබල් කිරීම සඳහා අනෙකුත් ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂවල දායකත්වය විමර්ශනය කිරීම සඳහා, පිළිවෙළින් 18, 29 හයිඩ්‍රොක්සයිල් සහ සුපර් ඔක්සයිඩ් රැඩිකල් ස්කාවෙන්ජර් පිහිටුවීම සඳහා මැනිටෝල් සහ විටමින් සී එකතු කරන ලද නමුත් ඒවා ලේබල් කිරීම අඩු කිරීමට සොයා ගත්තේ නැත.H2O2 එකතු කිරීම, නමුත් ආලෝකය නොවේ, ලේබල් කිරීම සිදු නොවීය (පරිපූරක Fig. 3a).HEK293T-miniSOG වයරය තුළ තනි ඔක්සිජන් පවතින බව Si-DMA පරීක්ෂණ සමඟින් ප්‍රතිදීප්ත තනි ඔක්සිජන් ප්‍රතිබිම්බය මගින් තහවුරු කරන ලද නමුත් මුල් HEK293T වයර්හි නොවේ.මීට අමතරව, mitoSOX Red හට ආලෝකයෙන් පසු සුපර් ඔක්සයිඩ් නිෂ්පාදනය හඳුනා ගැනීමට නොහැකි විය (රූපය 1e සහ පරිපූරක Fig. 3b) 30. මෙම දත්ත තරයේ යෝජනා කරන්නේ තනි ඔක්සිජන් පසුව ප්‍රෝටෝමික් ලේබල් කිරීම සඳහා වගකිව යුතු ප්‍රධාන ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂය බවයි.PDPL හි සයිටොටොක්සිසිටි නිල් ආලෝක විකිරණ සහ රසායනික පරීක්ෂණ ඇතුළුව තක්සේරු කරන ලද අතර සැලකිය යුතු සයිටොටොක්සිසිටි බවක් දක්නට නොලැබුණි (පරිපූරක Fig. 4a).
ලේබල් කිරීමේ යාන්ත්‍රණය අධ්‍යයනය කිරීම සහ LC-MS/MS භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ හඳුනාගැනීම සක්‍රීය කිරීම සඳහා, අපි මුලින්ම වෙනස් කර ඇත්තේ කුමන ඇමයිනෝ අම්ලද සහ පරීක්ෂණ ලේබලවල ඩෙල්ටා ස්කන්ධයද යන්න තීරණය කළ යුතුය.මෙතියොනීන්, හිස්ටයිඩින්, ට්‍රිප්ටෝෆාන් සහ ටයිරොසීන් තනි ඔක්සිජන්14,15 මගින් වෙනස් කරන බව වාර්තා වී ඇත.අපි TOP-ABPP31 කාර්ය ප්‍රවාහය MSFragger32 මත පදනම් වූ FragPipe පරිගණක වේදිකාව විසින් සපයන ලද අපක්ෂපාතී විවෘත සෙවීම සමඟ ඒකාබද්ධ කරමු.සිංගල්ට් ඔක්සිජන් වෙනස් කිරීම සහ රසායනික පරීක්ෂණ ලේබල් කිරීමෙන් පසුව, නියුට්‍රාවිඩින් දිගු කිරීම සහ ට්‍රයිප්සින් ජීර්ණය මගින් ක්ලිව් කළ හැකි සම්බන්ධකයක් අඩංගු බයෝටින් අඩු කිරීමේ ලේබලයක් භාවිතයෙන් ක්ලික් රසායන විද්යාව සිදු කරන ලදී.LC-MS/MS විශ්ලේෂණය සඳහා තවමත් දුම්මලයට බැඳී ඇති නවීකරණය කරන ලද පෙප්ටයිඩය ඡායාරූපගත කරන ලදී (රූපය 2a සහ අතිරේක දත්ත 1).50කට අධික පෙප්ටයිඩ සිතියම් (PSM) ගැලපීම් ලැයිස්තුගත කර ඇති ප්‍රෝටියෝමය පුරා විශාල වෙනස් කිරීම් සංඛ්‍යාවක් සිදු විය (රූපය 2b).පුදුමයට කරුණක් නම්, අපි හිස්ටයිඩින් වෙනස් කිරීම පමණක් නිරීක්ෂණය කළෙමු, සමහර විට අනෙකුත් ඇමයිනෝ අම්ල වලට වඩා ඇනිලීන් පිරික්සුම් දෙසට ඔක්සිකරණය වූ හිස්ටයිඩින් ඉහළ ප්‍රතික්‍රියාශීලීත්වය නිසා විය හැකිය.සිංගල්ට් ඔක්සිජන් මගින් හිස්ටයිඩින් ඔක්සිකරණය කිරීමේ ප්‍රකාශිත යාන්ත්‍රණයට අනුව, +229 Da හි යෝජිත ඩෙල්ටා ස්කන්ධ ව්යුහය ඔක්සිකරණ දෙකකට පසුව 2-ඔක්සෝ-හිස්ටිඩින් සමඟ ප්‍රොබ් 3 එකතු කිරීමට අනුරූප වන අතර +247 Da යනු ජල විච්ඡේදක නිෂ්පාදනයයි. +229 Da (පරිපූරක රූපය 5).MS2 වර්ණාවලියේ ඇගයීම මගින් බොහෝ y සහ b අයන හඳුනාගැනීමේ ඉහළ විශ්වසනීයත්වයක් පෙන්නුම් කරන ලදී, නවීකරණය කරන ලද ඛණ්ඩක අයන (y සහ b) හඳුනාගැනීම ඇතුළුව (රූපය 2c).PDPL-වෙනස් කරන ලද histidines හි දේශීය අනුපිළිවෙලෙහි සන්දර්භය විශ්ලේෂණය ± 1 ස්ථානවල කුඩා ජලභීතික අපද්‍රව්‍ය සඳහා මධ්‍යස්ථ මෝස්තර මනාපයක් අනාවරණය කළේය (පරිපූරක Fig. 4b).සාමාන්‍යයෙන්, එක් ප්‍රෝටීනයකට හිස්ටයිඩීන් 1.4ක් හඳුනාගෙන ඇති අතර, මෙම සලකුණු වල ස්ථාන ද්‍රාවක ප්‍රවේශ විය හැකි පෘෂ්ඨ වර්ගඵලය (SASA) සහ සාපේක්ෂ ද්‍රාවක ලබා ගැනීමේ හැකියාව (RSA) විශ්ලේෂණය (පරිපූරක Fig. 4c,d) මගින් තීරණය කරන ලදී.
MSFragger මගින් බල ගැන්වෙන FragPipe පරිගණක වේදිකාව භාවිතයෙන් අවශේෂ තේරීම් අධ්‍යයනය සඳහා අපක්ෂපාතී කාර්ය ප්‍රවාහයක්.ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් ෙරසින් වලින් වෙනස් කරන ලද පෙප්ටයිඩවල ඡායා බෙදීමට ඉඩ දීම සඳහා ක්ලික් රසායන විද්‍යාවේදී ක්ලීවබල් ලින්කර් භාවිතා වේ.බොහෝ වෙනස් කිරීම් මෙන්ම අදාළ අවශේෂ හඳුනා ගැනීම සඳහා විවෘත සෙවුමක් දියත් කරන ලදී.b ප්‍රෝටියෝමය පුරා සිදුවන වෙනස් කිරීම් ස්කන්ධය පවරන්න.පෙප්ටයිඩ සිතියම්කරණය PSM.c MS2 හිස්ටයිඩින් අඩවිවල වර්ණාවලි විවරණයක් විමර්ශනය 3 සමඟ වෙනස් කරන ලදී. නියෝජන උදාහරණයක් ලෙස, පරීක්ෂණ 3 සමඟ සහසංයුජ ප්‍රතික්‍රියාවක් නවීකරණය කරන ලද ඇමයිනෝ අම්ලයට +229.0938 Da එකතු කරන ලදී.d PDPL සලකුණු සඳහා පරීක්ෂා කිරීමට භාවිතා කරන විකෘති විශ්ලේෂණය.PRDX3 (H155A, H225A) සහ PRDX1 (H10A, H81A, H169A) කොඩි විරෝධී හඳුනාගැනීම සඳහා වල් වර්ගයේ ප්ලාස්මිඩ් සමඟ මාරු කරන ලදී.e කෘත්‍රිම පෙප්ටයිඩය පිරික්සුම් 3 ඉදිරියේ පිරිසිදු miniSOG සමඟ ප්‍රතික්‍රියා කරන ලද අතර LC-MS වර්ණාවලියේ Δm +247 සහ +229 සමඟ අනුරූප නිෂ්පාදන සටහන් විය.f In vitro protein-to-protein අන්තර්ක්රියා miniSOG-6xHis-tag සහ anti-6xHis ප්රතිදේහ සමඟින් ආකෘතිගත කර ඇත.Antibiotin (streptavidin-HRP) සහ miniSOG-6xHis/anti-6xHis ප්රතිදේහ සංකීර්ණවල ප්‍රති-මූසික වෙස්ටර්න් බ්ලට් විශ්ලේෂණය, ආලෝකයට නිරාවරණය වන කාලය මත පදනම්ව, පරීක්ෂණ 3 සමඟ ලේබල් කර ඇත.තනි ප්‍රෝටීන සඳහා ලේබල් අනුරූප අණුක බරින් ප්‍රකාශ වේ: LC ප්රතිදේහ ආලෝක දාමය, HC ප්රතිදේහ බර දාමය.මෙම අත්හදා බැලීම් සමාන ප්රතිඵල සහිතව අවම වශයෙන් දෙවරක්වත් ස්වාධීනව නැවත නැවතත් සිදු කරන ලදී.
ලේබල් කිරීමේ අඩවියේ ජෛව රසායනික සත්‍යාපනය සඳහා, ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය මගින් හඳුනාගෙන ඇති PRDX3 සහ PRDX1 histidine සිට alanine දක්වා වෙනස් කරන ලද අතර සංක්‍රමණ පරීක්ෂණවල වල් වර්ගයට සාපේක්ෂව.PDPL ප්රතිඵල පෙන්නුම් කළේ විකෘතිය ලේබල් කිරීම සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කරන බවයි (රූපය 2d).මේ අතර, විවෘත සෙවුමේදී හඳුනාගත් පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් LC-MS මගින් අනාවරණය කරගත් විට +247 සහ +229 Da ස්කන්ධ මාරුවක් සහිත නිෂ්පාදන ලබා දෙමින්, probe 3 සහ නිල් ආලෝකය ඉදිරියේ පිරිසිදු miniSOG සමඟින් vitro තුළ ප්‍රතික්‍රියා කරන ලදී. .2e).)miniSOG photoactivation වලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් අන්තර්ක්රියා කරන සමීප ප්‍රෝටීන් vitro තුළ ලේබල් කළ හැකිද යන්න පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි miniSOG-6xHis ප්‍රෝටීනය සහ Vitro හි ප්‍රති-His monoclonal ප්‍රතිදේහයක් අතර අන්තර්ක්රියා මගින් කෘතිම සමීපතා තක්සේරුවක් නිර්මාණය කළෙමු (රූපය 2f).මෙම විශ්ලේෂණයේදී, අපි miniSOG සමඟ ප්රතිදේහ බර සහ සැහැල්ලු දාමවල සමීප ලේබල් කිරීම අපේක්ෂා කළෙමු.ඇත්ත වශයෙන්ම, ප්‍රති-මූසිකය (ප්‍රති-6xHis-ලේබල් කරන ලද ප්‍රතිදේහයේ බර සහ සැහැල්ලු දාම හඳුනා ගැනීම) සහ ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් වෙස්ටර්න් බ්ලට්ස් බර සහ සැහැල්ලු දාමවල ප්‍රබල බයෝටයිනයිලේෂන් පෙන්නුම් කළේය.සැලකිය යුතු ලෙස, 6xHis ටැගය සහ සැහැල්ලු සහ බර දාම අතර හරස්-සම්බන්ධතා හේතුවෙන් miniSOG autobiotinylation අපි දුටුවෙමු, එය ලයිසීන් සහ 2-oxo-histidine සමීප ප්‍රතිචාරය අතර කලින් විස්තර කර ඇති පරතරයට සම්බන්ධ විය හැකිය.අවසාන වශයෙන්, අපි නිගමනය කරන්නේ PDPL හිස්ටිඩීන් සමීපත්වය රඳා පවතින ආකාරයෙන් වෙනස් කරන බවයි.
අපගේ මීළඟ ඉලක්කය වූයේ ස්ථානගත ලේබල් කිරීමේ විශේෂත්වය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා උප සෛලීය ප්‍රෝටියෝමය සංලක්ෂිත කිරීමයි.එබැවින්, අපි HEK293T සෛලවල න්‍යෂ්ටිය, මයිටොකොන්ඩ්‍රිය න්‍යාසය හෝ පිටත ER පටලයෙහි miniSOG ස්ථාවරව ප්‍රකාශ කළෙමු (රූපය 3a).ජෙල් ප්‍රතිදීප්ත විශ්ලේෂණය මගින් උප සෛලීය ස්ථාන තුනක බහුල ලෙස ලේබල් කරන ලද පටි මෙන්ම විවිධ ලේබල් කිරීමේ රටා (රූපය 3b) අනාවරණය විය.ප්‍රතිදීප්ත රූප විශ්ලේෂණය PDPL හි ඉහළ නිශ්චිතතාවයක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 3c).PDPL කාර්ය ප්‍රවාහය ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන් උප සෛලීය ප්‍රෝටියෝම් නිරූපණය කිරීම සඳහා රෝඩමයින් ඩයි සමඟ ක්ලික් ප්‍රතික්‍රියා මගින් අනුගමනය කරන ලදී, සහ PDPL සංඥා DAPI, මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ට්‍රැකර් හෝ ER ට්‍රැකර් සමඟ ඒකාබද්ධ කර PDPL හි ඉහළ විශ්වාසවන්තභාවය තහවුරු කරයි.ඉන්ද්‍රිය ස්ථාන තුන සඳහා, avidin western blot භාවිතා කරමින් TurboID සමඟ PDPL එක පැත්තකින් සංසන්දනය කිරීමෙන් පෙන්නුම් කළේ PDPL ඒවායේ අදාළ පාලනයන්ට සාපේක්ෂව වඩාත් නිශ්චිතව ලේබල් කර ඇති බවයි.PDPL තත්වයන් යටතේ, PDPL-ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීන් වැඩි ගණනක් පෙන්නුම් කරමින්, ලේබල් කළ පටි වැඩි ගණනක් දර්ශනය විය (පරිපූරක Fig. 6a-d).
miniSOG-මැදිහත් වූ ඉන්ද්‍රිය-විශේෂිත ප්‍රෝටියෝම් ලේබල් කිරීමේ ක්‍රමානුකූල නිරූපණයකි.miniSOG විසින් මානව COX4 (mito-miniSOG) හි N-පර්යන්ත 23 ඇමයිනෝ අම්ල වෙත විලයනය හරහා මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් අනුකෘතිය ඉලක්ක කරයි, න්‍යෂ්ටිය H2B (nucleus-miniSOG) වෙත විලයනය හරහා සහ Sec61β ER පටලයේ (ER-miniSOG) සයිටොප්ලාස්මික් පැත්ත හරහා )ඇඟවුම් අතරට ජෙල් රූප, කොන්ෆෝකල් රූප සහ ස්කන්ධ වර්ණාවලිමිතිය ඇතුළත් වේ.b ඉන්ද්‍රිය-විශේෂිත PDPL පැතිකඩ තුනක නියෝජිත ජෙල් රූප.CBB Coomassie Brilliant Blue.c V5 (රතු) ලෙස ලේබල් කරන ලද ප්රතිදේහ මගින් අනාවරණය කරගත් විවිධ උපසෛලීය ප්‍රාදේශීයකරණයන් සහිත miniSOG ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරන HEK293T සෛලවල නියෝජිත confocal රූප.මයිටොකොන්ඩ්‍රියා සහ ඊආර් (කොළ) සඳහා උප සෛලීය සලකුණු භාවිතා වේ.PDPL කාර්ය ප්‍රවාහයට Cy3-azide ක්ලික් රසායන විද්යාව භාවිතයෙන් miniSOG (කහ) ලේබල් කරන ලද උප සෛල ප්‍රෝටියෝම හඳුනාගැනීම ඇතුළත් වේ.පරිමාණ තීරුව: 10 µm.d ලේබල් නොකළ ප්‍රමාණකරණය (n = 3 ස්වාධීන ජීව විද්‍යාත්මක අත්හදා බැලීම්) මගින් ප්‍රමාණ කරන ලද විවිධ ඉන්ද්‍රියවල PDPL-ටැග් කළ ප්‍රෝටියෝම්වල ගිනිකඳු බිම් කොටස්.ද්වි-වලිග ශිෂ්‍යයාගේ ටී-පරීක්ෂණය ගිනිකඳු බිම් මත භාවිතා කරන ලදී.HEK293T වල් වර්ගය සෘණ පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වූ ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ >2-ගුණයක අයන තීව්‍රතා වෙනස). සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වූ ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ >2-ගුණයක අයන තීව්‍රතා වෙනස). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и >2-кратная разница в интенсивност). සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් කරන ලද ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ >අයන තීව්‍රතාවයේ 2 ගුණයක වෙනස).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силее). සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් කරන ලද ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ > අයනික ශක්තියේ 2 ගුණයක වෙනස).HEK293T-miniSOG සඳහා වැදගත් වන නමුත් HEK293T සඳහා වැදගත් නොවන අදාළ ප්‍රෝටීන කොළ පැහැයෙන් පෙන්වා ඇත.ඊ අත්හදා බැලීම් වලින් ප්‍රෝටෝමික් දත්ත කට්ටලවල විශේෂත්වය විශ්ලේෂණය කිරීම d.එක් එක් ඉන්ද්‍රියයේ (රතු සහ කොළ පැහැති තිත්) සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු ප්‍රෝටීන සංඛ්‍යාව ඉහළින් සලකුණු කර ඇත.Histograms පෙන්නුම් කරන්නේ MitoCarta 3.0, GO විශ්ලේෂණය සහ A. Ting et al මත පදනම් වූ ඉන්ද්‍රියයන් තුළ ස්ථානගත කර ඇති ප්‍රෝටීන.මහජන.මයිටොකොන්ඩ්‍රියා, න්‍යෂ්ටික සහ ER සඳහා වෙනම දත්ත කට්ටල.මෙම අත්හදා බැලීම් සමාන ප්රතිඵල සහිතව අවම වශයෙන් දෙවරක්වත් ස්වාධීනව නැවත නැවතත් සිදු කරන ලදී.අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ආකාරයෙන් සපයනු ලැබේ.
ජෙල් සහ රූපකරණ ප්‍රතිඵලවලින් දිරිමත් වූ අතර, එක් එක් ඉන්ද්‍රිය තුළ හඳුනාගත් ප්‍රෝටියෝමය ප්‍රමාණ කිරීමට ලේබල් රහිත ප්‍රමාණකරණය භාවිතා කරන ලදී (පරිපූරක දත්ත 2).පසුබිම් සලකුණු අඩු කිරීමට සෘණ පාලනයක් ලෙස මාරු නොකළ HEK293T භාවිතා කරන ලදී. ගිනිකඳු කුමන්ත්‍රණ විශ්ලේෂණය සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් කරන ලද ප්‍රෝටීන (p <0.05 සහ >2-ගුණයක අයන තීව්‍රතාවය) මෙන්ම miniSOG-ප්‍රකාශන රේඛාවල පමණක් පවතින තනි ප්‍රෝටීන (පය. 3d රතු සහ කොළ තිත්) පෙන්වයි. ගිනිකඳු කුමන්ත්‍රණ විශ්ලේෂණය සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් කරන ලද ප්‍රෝටීන (p <0.05 සහ >2-ගුණයක අයන තීව්‍රතාවය) මෙන්ම miniSOG-ප්‍රකාශන රේඛාවල පමණක් පවතින තනි ප්‍රෝටීන (පය. 3d රතු සහ කොළ තිත්) පෙන්වයි. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ගිනිකඳු කුමන්ත්‍රණ විශ්ලේෂණය සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් කරන ලද ප්‍රෝටීන (p<0.05 සහ >2-ගුණයක අයන තීව්‍රතාවය) මෙන්ම miniSOG-ප්‍රකාශන රේඛාවල පමණක් පවතින තනි ප්‍රෝටීන (පය. 3d, රතු සහ කොළ තිත්) පෙන්නුම් කළේය.火山图 分析 出 显着出火山图 分析 显示显示 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ගිනිකඳු කුමන්ත්‍රණ විශ්ලේෂණය මගින් සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් කරන ලද ප්‍රෝටීන (p<0.05 සහ >2x අයනික ශක්තිය) මෙන්ම miniSOG ප්‍රකාශන රේඛාවේ පමණක් පවතින තනි ප්‍රෝටීන (රූපය 3d හි රතු සහ කොළ තිත්) අනාවරණය විය.මෙම දත්ත ඒකාබද්ධ කරමින්, අපි පිළිවෙළින් සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු න්‍යෂ්ටික, මයිටොකොන්ඩ්‍රිය සහ ER පිටත පටල ප්‍රෝටීන 1364, 461, සහ 911 හඳුනා ගත්තෙමු.organelle-localized PDPL හි නිරවද්‍යතාවය විශ්ලේෂණය කිරීමට, අපි MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) විශ්ලේෂණය සහ A. Ting et al භාවිතා කළෙමු.73.4, 78.5, සහ 73.0% ක නිරවද්‍යතාවකට අනුරූප වන, අනාවරණය කරගත් ප්‍රෝටීනවල ඉන්ද්‍රිය විශේෂත්වය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා මයිටොකොන්ඩ්‍රියා, න්‍යෂ්ටිය සහ ER සඳහා දත්ත කට්ටල8 භාවිතා කරන ලදී (රූපය 3e).PDPL හි විශේෂත්වය PDPL යනු ඉන්ද්‍රිය-විශේෂිත ප්‍රෝටියෝම් හඳුනාගැනීම සඳහා කදිම මෙවලමක් බව තහවුරු කරයි.සැලකිය යුතු ලෙස, හඳුනාගත් මයිටොකොන්ඩ්‍රිය ප්‍රෝටීන වල submitochondrial විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ සිරවී ඇති ප්‍රෝටියෝමය ප්‍රධාන වශයෙන් න්‍යාසයේ සහ අභ්‍යන්තර පටලයේ (පිළිවෙලින් 226 සහ 106) බෙදා හැර ඇති බවයි, එය හඳුනාගෙන ඇති මුළු මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ප්‍රෝටීන සංඛ්‍යාවෙන් 91.7% (362) ක් වේ.PDPL හි ඉහළ මට්ටමක් අතිරේකව තහවුරු කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 7a).ඒ හා සමානව, උප න්‍යෂ්ටික විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ ග්‍රහණය කරගත් ප්‍රෝටෝමය ප්‍රධාන වශයෙන් න්‍යෂ්ටිය, නියුක්ලියෝප්ලාස්ම් සහ නියුක්ලියෝලස් වල බෙදා හරින බවයි (පරිපූරක Fig. 7b).න්‍යෂ්ටික ප්‍රාදේශීයකරණ සංඥා පෙප්ටයිඩ (3xNLS) සමඟ න්‍යෂ්ටික ප්‍රෝටෝමික් විශ්ලේෂණය H2B නිර්මිතයට සමාන නිරවද්‍යතාවයක් පෙන්නුම් කළේය (පරිපූරක Fig. 7c-h).PDPL සලකුණෙහි නිශ්චිතභාවය තීරණය කිරීම සඳහා, න්‍යෂ්ටික ලැමිනින් A වඩාත් විවික්ත ලෙස ස්ථානගත කරන ලද POI7 උගුලක් ලෙස තෝරා ගන්නා ලදී.PDPL සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් කරන ලද ප්‍රෝටීන 36ක් හඳුනාගෙන ඇති අතර, ඉන් ප්‍රෝටීන 12ක් (ලැමින් A ඇතුළුව 30.0%) හොඳින් සංලක්ෂිත lamin A අන්තර්ක්‍රියාකාරී ප්‍රෝටීන වන අතර String දත්ත සමුදාය මගින් විවරණය කරන ලදී, BioID ක්‍රමයට වඩා වැඩි ප්‍රතිශතයක් (ප්‍රෝටීන 122) 28 න් 28. , 22.9 %) 7. අපගේ ක්‍රමය අඩු ප්‍රෝටීන් හඳුනාගෙන ඇත, සමහර විට සීමිත ලේබල් කිරීමේ ප්‍රදේශ නිසා, එය වඩාත් ක්‍රියාකාරී තනි ඔක්සිජන් මගින් හැකි විය.GO විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන ප්‍රධාන වශයෙන් නියුක්ලියෝප්ලාස්ම් (26), න්‍යෂ්ටික පටල (10), න්‍යෂ්ටික පටල (9) සහ න්‍යෂ්ටික සිදුරු (5) තුළ පිහිටා ඇති බවයි.සාමූහිකව, මෙම න්‍යෂ්ටික-දේශීය ප්‍රෝටීන් පොහොසත් කරන ලද ප්‍රෝටීන වලින් 80% ක් වන අතර, PDPL හි විශේෂත්වය තවදුරටත් පෙන්නුම් කරයි (පරිපූරක Fig. 8a-d).
ඉන්ද්‍රියයන් තුළ සමීප ලකුණු කිරීම සිදු කිරීමට PDPL හි හැකියාව තහවුරු කර ගැනීමෙන් පසුව, POI බන්ධන හවුල්කරුවන් විශ්ලේෂණය කිරීමට PDPL භාවිතා කළ හැකිද යන්න අපි පරීක්ෂා කළෙමු.විශේෂයෙන්, අපි සයිටොසොලික් ප්‍රෝටීන වල PDPL විශ්ලේෂණය නිර්වචනය කිරීමට උත්සාහ කළෙමු, ඒවායේ ඉතා ගතික ස්වභාවය හේතුවෙන් ඒවායේ පටල-දේශීය සගයන්ට වඩා දුෂ්කර ඉලක්ක ලෙස සැලකේ.Bromodomain සහ extraterminal (BET) ප්‍රෝටීන් BRD4 විවිධ රෝග 35, 36 සඳහා එහි ප්‍රධාන භූමිකාව සඳහා අපගේ අවධානය ආකර්ෂණය කර ඇත.BRD4 විසින් සාදන ලද සංකීර්ණය පිටපත් කිරීමේ කෝක්ටිවේටරයක් සහ වැදගත් චිකිත්සක ඉලක්කයකි.c-myc සහ Wnt5a පිටපත් කිරීමේ සාධකවල ප්‍රකාශනය නියාමනය කිරීමෙන්, BRD4 උග්‍ර මයිලෝයිඩ් ලියුකේමියාව (AML), බහු මයිලෝමා, බර්කිට්ගේ ලිම්ෆෝමාව, මහා බඩවැලේ පිළිකා සහ ගිනි අවුලුවන රෝග සඳහා ප්‍රධාන නිර්ණායකයක් ලෙස සැලකේ.මීට අමතරව, සමහර වෛරස් පැපිලෝමා වයිරසය, HIV, සහ SARS-CoV-236,39 වැනි වෛරස් සහ සෛලීය පිටපත් කිරීම නියාමනය කිරීමට BRD4 ඉලක්ක කරයි.
PDPL භාවිතයෙන් BRD4 අන්තර්ක්රියා සිතියම්ගත කිරීම සඳහා, අපි BRD4 හි කෙටි N- හෝ C-පර්යන්ත සමස්ථානිකයක් සමඟ miniSOG ඒකාබද්ධ කළෙමු.ප්‍රෝටෝමික් ප්රතිඵල මගින් නිර්මිත දෙක අතර අතිච්ඡාදනය ඉහළ මට්ටමක පවතින බව අනාවරණය විය (පරිපූරක Fig. 9a).miniSOG-H2B සමඟ හඳුනාගත් න්‍යෂ්ටික ප්‍රෝටෝමය BRD4 සමඟ අන්තර්ක්රියා කරන ප්‍රෝටීන වලින් 77.6%ක් ආවරණය කරයි (පරිපූරක Fig. 9b).ඉන්පසුව, මාර්කර් අරය සකස් කිරීම සඳහා ආලෝකයේ විවිධ වේලාවන් (විනාඩි 2, 5, 10, 20) භාවිතා කරන ලදී (රූපය 4a සහ අතිරේක දත්ත 3).කෙටි ඡායා කාල පරිච්ඡේදවලදී, PDPL මූලික වශයෙන් සෘජු බන්ධන හවුල්කරුවන් ලේබල් කරන අතර, දිගු කාලපරිච්ඡේදවලට කෙටි ඡායාරූප සක්‍රීය කිරීමේ කාල පරිච්ඡේදවලදී හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන මෙන්ම ලේබල් කිරීමේ සංකීර්ණවල වක්ර ඉලක්ක ඇතුළත් වන බව අපි නිගමනය කරමු.ඇත්ත වශයෙන්ම, අපි යාබද කාල ලක්ෂ්‍ය අතර ප්‍රබල අතිච්ඡාදනය සොයා ගත්තෙමු (විනාඩි 2 සහ 5 සඳහා 84.6%; විනාඩි 5 සහ 10 සඳහා 87.7%; විනාඩි 10 සහ 20 සඳහා 98.7%) (රූපය 4b සහ පරිපූරක Fig. 9c ).සියලුම පර්යේෂණාත්මක කණ්ඩායම් තුළ, අපි BRD4 ස්වයං-ලේබල් කිරීම පමණක් නොව, තන්තු දත්ත ගබඩාවේ සටහන් කර ඇති MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A සහ HMGB1 වැනි දන්නා ඉලක්ක කිහිපයක් සොයා ගත්තෙමු.මෙම ඉලක්ක වල අයනික ශක්තිය නිරාවරණ කාලයට සමානුපාතික වේ (රූපය 4c සහ පරිපූරක Fig. 9d).මිනිත්තු 2 ක කණ්ඩායම තුළ හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන වල GO විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන න්‍යෂ්ටිය තුළ ස්ථානගත කර ඇති අතර ක්‍රොමැටින් ප්‍රතිනිර්මාණය සහ RNA පොලිමරේස් ක්‍රියාකාරිත්වයට සම්බන්ධ වී ඇති බවයි.ප්‍රෝටීනයේ අණුක ක්‍රියාකාරිත්වය BRD4 ශ්‍රිතයට අනුරූප වන ක්‍රොමැටින් බන්ධන හෝ පිටපත් කිරීමේ සහයෝගීතාවයෙන් පොහොසත් විය (රූපය 4d).තන්තු දත්ත සමුදාය-සක්‍රීය ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්රියා විශ්ලේෂණය BRD4 සහ HDAC බන්ධන ඇසිටිලේටඩ් හිස්ටෝන වලට අනුකූල වන SIN3A, NCOR2, BCOR, සහ SAP130 (Fig. 4e සහ පරිපූරක Fig. 9e) වැනි BRD4 සහ HDAC පවුල් අන්තර්ක්රියා සංකීර්ණ අතර පළමු මට්ටමේ වක්ර අන්තර්ක්රියා අනාවරණය විය. ..මීට අමතරව, Sin3A, NSUN2, Fus, සහ SFPQ ඇතුළුව LC-MS/MS විසින් හඳුනාගත් නියෝජිත ඉලක්ක බටහිර බ්ලොටින් මගින් තහවුරු කරන ලදී (රූපය 4f).මෑතදී, BRD4 හි කෙටි සමස්ථානිකය ද්‍රව-ද්‍රව අවධි වෙන් කිරීමේ (LLPS) ගුණාංග සහිත න්‍යෂ්ටීන් සාදන බව වාර්තා විය.RNA බන්ධන ප්‍රෝටීන Fus සහ SFPQ විවිධ සෛලීය ක්‍රියාවලීන්ගේ LLPS මැදිහත් වන අතර මෙහි වාර්තා නොකළ BRD4 බන්ධන ප්‍රෝටීන ලෙස හඳුනාගෙන ඇත.BRD4 සහ SFPQ අතර අන්තර්ක්රියා සම-ප්රතිශක්තිකරණ (co-IP) අත්හදා බැලීම් මගින් තහවුරු කරන ලදී (රූපය 4g), වැඩිදුර විමර්ශනයට සුදුසු BRD4-මැදිහත් වූ ද්‍රව-දියර අවධි වෙන් කිරීම සඳහා තවත් යාන්ත්‍රණයක් යෝජනා කරයි.එකට ගත්විට, මෙම ප්රතිඵල යෝජනා කරන්නේ දන්නා BRD4 අන්තර්ක්රියා මෙන්ම නොදන්නා බන්ධන ප්‍රෝටීන හඳුනාගැනීම සඳහා PDPL කදිම වේදිකාවක් බවයි.
miniSOG-මැදිහත් BRD4 සමීප සලකුණු වල ක්‍රමානුරූප නිරූපණය, නිරාවරණ වේලාවන්: 2, 5, 10, සහ 20 min.b විවිධ ආලෝක කාලවලදී හඳුනාගත් ප්‍රෝටීනවල අතිච්ඡාදනය.HEK293T-miniSOG-BRD4 හි හඳුනාගෙන ඇති ප්‍රෝටීන් පොහොසත් කිරීම වල් වර්ගයේ HEK293T හා සසඳන විට සංඛ්‍යානමය වශයෙන් වැදගත් වේ.c නිශ්චිත නිරාවරණ කාලය තුළ ලේබල් නොකළ නියෝජිත දන්නා BRD4-බන්ධන ප්‍රෝටීන ප්‍රමාණනය කිරීමේදී අයන තීව්‍රතාවය.n = 3 ජීව විද්‍යාත්මකව ස්වාධීන සාම්පල.දත්ත මධ්යන්ය ± සම්මත අපගමනය ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ.d මිනිත්තු 2 ක කණ්ඩායම තුළ හඳුනාගෙන ඇති ප්‍රෝටීන වල ජාන ඔන්ටොලොජිකල් විශ්ලේෂණය (GO).පළමු GO නියමයන් දහය ලැයිස්තුගත කර ඇත.GO පද කාණ්ඩයට අනුව බුබුලු වර්ණ ගන්වා ඇති අතර, බුබුලු ප්‍රමාණය එක් එක් පදයේ ඇති ප්‍රෝටීන ගණනට සමානුපාතික වේ.e BRD4 සමඟ අන්තර්ක්රියා කරන ප්‍රෝටීන වල නූල් විශ්ලේෂණය.කහ රවුම් සෘජු මැලියම් වන අතර අළු රවුම් වක්ර මැලියම්වල පළමු ස්ථරය වේ.රතු රේඛා පර්යේෂණාත්මකව තීරණය කරන ලද අන්තර්ක්රියා නියෝජනය කරන අතර නිල් රේඛා පුරෝකථනය කළ අන්තර්ක්රියා නියෝජනය කරයි.f LC-MS/MS හි හඳුනාගත් නියෝජිත BRD4 බන්ධන ඉලක්ක බටහිර බ්ලොටින් මගින් සත්‍යාපනය කරන ලදී.g සම-ප්රතිශක්තිකරණ පරීක්ෂණ මගින් SFPQ සහ BRD4 අතර අන්තර්ක්රියා තහවුරු කරයි.මෙම අත්හදා බැලීම් සමාන ප්රතිඵල සහිතව අවම වශයෙන් දෙවරක්වත් ස්වාධීනව නැවත නැවතත් සිදු කරන ලදී.අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ආකාරයෙන් සපයනු ලැබේ.
ලියාපදිංචි නොකළ POI ආශ්‍රිත ඉලක්ක හඳුනාගැනීමට අමතරව, ලියාපදිංචි නොකළ උපස්ථර සටහන් කිරීමට විශාල සංකීර්ණවල වක්ර බන්ධන ප්‍රෝටීනවල ගුනාංගීකරනය අවශ්‍ය වන එන්සයිම සඳහා උපස්ථර හඳුනාගැනීම සඳහා PDPL සුදුසු වනු ඇතැයි අපි උපකල්පනය කරමු.පාකින් (PARK2 මගින් කේතනය කර ඇත) යනු E3 ලිගස් එකක් වන අතර පාකින් වල ඇති විකෘති ස්වයංක්‍රීය අවපාත බාල පාකින්සන් රෝගය (AR-JP) 42 ඇති කරන බව දන්නා කරුණකි.මීට අමතරව, පාර්කින් මයිටොෆාජි (මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ඔටෝෆාජි) සහ ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂ ඉවත් කිරීම සඳහා අත්‍යවශ්‍ය බව විස්තර කර ඇත.කෙසේ වෙතත්, පාකින් උපස්ථර කිහිපයක් හඳුනාගෙන ඇතත්, මෙම රෝගය තුළ පාකින් වල කාර්යභාරය අපැහැදිලි වේ.එහි සංලක්ෂිත නොවූ උපස්ථර සටහන් කිරීම සඳහා, PDPL miniSOG පාකින් හි N- හෝ C-පර්යන්තයට එක් කිරීම මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී.PINK1-Parkin මාර්ගය හරහා පාර්කින් සක්‍රිය කිරීම සඳහා සෛල වලට carbonyl cyanide proton transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) සමඟ ප්රතිකාර කරන ලදී.අපගේ BRD4 PDPL ප්රතිඵල හා සසඳන විට, parkin N-terminus විලයන විශාල ඉලක්කගත ප්‍රෝටීන සමූහයක් අනාවරණය කර ඇත, නමුත් එය C-terminus හි විශාල කොටසක් (210 න් 177) ආවරණය කර ඇත (Figure 5a,b සහ අතිරේක දත්ත 4).ප්‍රතිඵලය N-terminal tags වලට Parkin44 අක්‍රිය කළ හැකි බවට වන වාර්තා සමග අනුකූල වේ.පුදුමයට කරුණක් නම්, Parkin43 සඳහා ප්‍රකාශිත AP-MS ප්රතිඵල සහිත අපගේ දත්තවල තිබුණේ අතිච්ඡාදනය වන ප්‍රෝටීන 18ක් පමණක් වන අතර, සෛල රේඛා සහ ප්‍රෝටෝමික්ස් වැඩ ප්රවාහ අතර ඇති වෙනස්කම් නිසා විය හැක.දන්නා ප්‍රෝටීන හතරකට අමතරව (ARDM1, HSPA8, PSMD14, සහ PSMC3) ක්‍රම දෙකකින් හඳුනාගෙන ඇත (රූපය 5c)43.LC-MS/MS හි ප්රතිඵල තවදුරටත් තහවුරු කිරීම සඳහා, HEK293T මාපිය සෛල විශ්ලේෂණය සහ ස්ථායී N-පර්යන්ත පාර්කින් රේඛාවේ ප්රතිඵල සංසන්දනය කිරීමට PDPL ප්‍රතිකාරය සහ පසුව බටහිර බ්ලොටින් භාවිතා කරන ලදී.කලින් නොදන්නා ඉලක්ක CDK2, DUT, CTBP1, සහ PSMC4 දන්නා බන්ධකයක්, DNAJB1 සමඟ පරීක්ෂා කරන ලදී (රූපය 5d).
ස්ථායීව ප්‍රකාශිත miniSOG සහිත HEK293T සෛල තුළ පාර්කින් අන්තර්ක්රියා කරන ප්‍රෝටීන වල ගිනිකඳු කුමන්ත්‍රණය N- හෝ C-පර්යන්තය පාකින් (n = 3 ස්වාධීන ජීව විද්‍යාත්මක පරීක්ෂණ) වෙත විලයනය කර ඇත.ද්වි-වලිග ශිෂ්‍යයාගේ ටී-පරීක්ෂණය ගිනිකඳු බිම් මත භාවිතා කරන ලදී.HEK293T සෘණ පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වූ ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ >2-ගුණයක අයන තීව්‍රතා වෙනස). සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වූ ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ >2-ගුණයක අයන තීව්‍රතා වෙනස). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и >2-кратная разница в интенсивност). සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් කරන ලද ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ >අයන තීව්‍රතාවයේ 2 ගුණයක වෙනස).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной силее). සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් කරන ලද ප්‍රෝටීන රතු පැහැයෙන් උද්දීපනය කෙරේ (p <0.05 සහ > අයනික ශක්තියේ 2 ගුණයක වෙනස).HEK293T-miniSOG සඳහා වැදගත් වන නමුත් HEK293T සඳහා වැදගත් නොවන අදාළ ප්‍රෝටීන කොළ පැහැයෙන් පෙන්වා ඇත.b N-පර්යන්ත සහ C-පර්යන්ත ඉදිකිරීම් අතර අතිච්ඡාදනය වන ප්‍රෝටීන පෙන්වන Venn රූප සටහන.N-ටර්මිනල් ටැග් මගින් පාර්කින් අක්‍රියව සක්‍රිය කර වඩාත් හඳුනාගත හැකි ප්‍රෝටීන ඇති කළ හැක.c Venn රූප සටහන PDPL සහ AP-MS අතර අතිච්ඡාදනය වන ප්‍රෝටීන පෙන්වයි.PDPL හි නිශ්චිතව හඳුනාගෙන ඇති අතිච්ඡාදනය වන ප්‍රෝටීන 18න් 4ක් සහ ප්‍රෝටීන 159න් 11ක් ඇතුළුව දන්නා අන්තර්ක්රියා ලැයිස්තුගත කර ඇත.d LC-MS/MS විසින් හඳුනා ගන්නා ලද නියෝජිත ඉලක්ක බටහිර බ්ලොටිං මගින් සත්‍යාපනය කරන ලදී.e Ssu72 සහ SNW1 ලියාපදිංචි නොකළ පාකින් උපස්ථර ලෙස හඳුනාගෙන ඇත.මෙම FLAG-ටැග් කරන ලද ප්‍රෝටීන් ප්ලාස්මිඩ් HEK293T සහ HEK293T-Parkin-miniSOG වෙත සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද අතර පසුව විවිධ කාලවලදී CCCP ප්‍රතිකාරය සිදු කරන ලදී.පාකින් අධි ප්‍රකාශන රේඛාවේ පරිහානිය වඩාත් කැපී පෙනුණි.f ප්‍රෝටිසෝම නිෂේධකය MG132 භාවිතා කරමින්, Ssu72 සහ SNW1 හි පිරිහීමේ ක්‍රියාවලිය ප්‍රෝටීසෝම-සර්ව පැතිරීම මගින් මැදිහත් වන බව තහවුරු විය.මෙම අත්හදා බැලීම් සමාන ප්රතිඵල සහිතව අවම වශයෙන් දෙවරක්වත් ස්වාධීනව නැවත නැවතත් සිදු කරන ලදී.අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ආකාරයෙන් සපයනු ලැබේ.
PDPL මගින් හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන වල පාකින් බන්ධන ප්‍රෝටීන සහ ඒවායේ උපස්ථර ඇතුළත් විය යුතු බව සැලකිය යුතුය.ලියාපදිංචි නොකළ පාකින් උපස්ථර හඳුනා ගැනීම සඳහා, අපි හඳුනාගත් ප්‍රෝටීන හතක් තෝරා ගත්තෙමු (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 සහ SNW1) සහ මෙම ජාන සාමාන්‍ය HEK293T වෙත නිරාවරණය කිරීම සඳහා ප්ලාස්මිඩ මාරු කළ අතර පසුව HEK2CC ප්‍රතිකාරය miniSOG-Parkin's ස්ථායීව ප්‍රකාශ කළෙමු.Ssu72 සහ SNW1 ප්‍රෝටීන වල මට්ටම් ස්ථායී miniSOG-Parkin රේඛාවේ (Fig. 5e) සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය.පැය 12 ක් සඳහා CCCP සමඟ ප්රතිකාර කිරීම උපස්ථර දෙකෙහිම වඩාත්ම සැලකිය යුතු පිරිහීම සඳහා හේතු විය.Ssu72 සහ SNW1 හි පිරිහීම ප්‍රෝටීසෝම-සර්ව පැතිරීම මගින් නියාමනය කරනු ලබන්නේද යන්න විමර්ශනය කිරීම සඳහා, ප්‍රෝටීසෝම ක්‍රියාකාරකම් නිෂේධනය කිරීම සඳහා MG132 ප්‍රෝටිසෝම නිෂේධකය එකතු කරන ලද අතර, ඇත්ත වශයෙන්ම අපි ඒවායේ ක්ෂය වීමේ ක්‍රියාවලිය වළක්වන බව සොයා ගත්තෙමු (රූපය 5f).අමතර උපස්ථර නොවන ඉලක්ක LC-MS/MS සමඟ අනුකූල ප්රතිඵල පෙන්නුම් කරන බටහිර බ්ලොටින් (පරිපූරක Fig. 10) භාවිතයෙන් පාකින් අන්තර්ක්‍රියාකාරක ලෙස තහවුරු කරන ලදී.අවසාන වශයෙන්, ඉලක්කගත ප්‍රෝටීන් සම්ප්‍රේෂණ සත්‍යාපනය සමඟ PDPL කාර්ය ප්‍රවාහය ඒකාබද්ධ කිරීම ලියාපදිංචි නොකළ E3 ligase උපස්ථර හඳුනා ගැනීමට ඉඩ සලසයි.
අපි ඔබට අවකාශය සහ කාලය අන්තර්ක්රියා කරන POI හඳුනා ගැනීමට ඉඩ සලසන පොදු සමීප සලකුණු කිරීමේ වේදිකාවක් සකස් කර ඇත.වේදිකාව පදනම් වී ඇත්තේ 12 kDa පමණ වන, පරිණත APEX2 එන්සයිමයේ (27 kDa) ප්‍රමාණයෙන් අඩකට වඩා අඩු සහ TurboID (35 kDa) ප්‍රමාණයෙන් තුනෙන් එකක් වන miniSOG ෆොටෝසෙන්සිටයිසර් ප්‍රෝටීනය මත ය.කුඩා ප්‍රමාණය කුඩා ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්රියා අධ්‍යයනය සඳහා යෙදුම් පරාසය විශාල ලෙස පුළුල් කළ යුතුය.ජානමය වශයෙන් කේතනය කරන ලද ප්‍රෝටීන හෝ කුඩා අණු වේවා, තනි ඔක්සිජන් වල ක්වොන්ටම් අස්වැන්න වැඩි කිරීමට සහ මෙම ප්‍රවේශයේ සංවේදීතාව පුළුල් කිරීමට අමතර ප්‍රභාසංවේදක පිළිබඳ වැඩිදුර ගවේෂණය අවශ්‍ය වේ.miniSOG හි වත්මන් අනුවාදය සඳහා, සමීප සලකුණු සක්‍රිය කිරීම සඳහා නිල් ආලෝකකරණය භාවිතයෙන් ඉහළ තාවකාලික විභේදනයක් ලබා ගත හැකිය.මීට අමතරව, දිගු නිරාවරණ කාලය තනි ඔක්සිජන් විශාල “වලාකුළක්” නිකුත් කළ අතර, එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස වැඩි දුරස්ථ හිස්ටයිඩින් අපද්‍රව්‍ය වෙනස් කිරීම, ලේබල් කිරීමේ අරය වැඩි කිරීම සහ PDPL අවකාශීය විභේදනය මනාව සකස් කිරීමේ හැකියාව ඇති විය.සංඥා-පසුබිම් අනුපාතය වැඩි කිරීම සඳහා අපි රසායනික පරීක්ෂණ හතක් ද පරීක්ෂා කළ අතර මෙම ප්‍රවේශය පිටුපස ඇති අණුක යාන්ත්‍රණය ගවේෂණය කළෙමු.TOP-ABPP කාර්ය ප්‍රවාහය අපක්ෂපාතී විවෘත සෙවීම් සමඟ ඒකාබද්ධව වෙනස් කිරීම් සිදුවී ඇත්තේ histidines වල පමණක් බවත්, loop කලාපයේ histidines සඳහා මධ්‍යස්ථ මනාපයක් හැර, histidine වැඩි දියුණු කිරීම් සඳහා ස්ථාවර ක්ෂුද්ර පරිසරයක් නිරීක්ෂණය නොකළ බවත් තහවුරු විය.
PDPL ද උප සෛලීය ප්‍රෝටියෝම් සංලක්ෂිත කිරීමට භාවිතා කර ඇත ප්‍රෝටියෝම් විශේෂත්වය සහ ආවරණය අවම වශයෙන් අනෙකුත් සමීප ලේබල් කිරීම සහ ඉන්ද්‍රිය-විශේෂිත රසායනික පරීක්ෂණ ක්‍රම සමඟ සැසඳිය හැක.මතුපිට, ලයිසොසෝම සහ ස්‍රාවය ආශ්‍රිත ප්‍රෝටියෝමයන් සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා සමීපතා සලකුණු ද සාර්ථකව භාවිතා කර ඇත.PDPL මෙම උප සෛලීය ඉන්ද්‍රියයන් සමඟ ගැළපෙන බව අපි විශ්වාස කරමු.මීට අමතරව, අපි PDPL අභියෝගයට ලක් කළේ ඒවායේ ගතික ගුණාංග සහ වඩාත් තාවකාලික අන්තර්ක්රියා වලට සම්බන්ධ වීම හේතුවෙන් පටල බැඳුනු ප්‍රෝටීන වලට වඩා සංකීර්ණ සයිටොසොලික් ප්‍රෝටීන බන්ධන සඳහා ඉලක්ක හඳුනා ගැනීමෙනි.PDPL ප්‍රෝටීන දෙකකට යොදන ලදී, පිටපත් කිරීමේ කෝක්ටිවේටරය BRD4 සහ රෝග ආශ්‍රිත ligase E3 Parkin.මෙම ප්‍රෝටීන දෙක තෝරාගනු ලැබුවේ ඒවායේ මූලික ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් සඳහා පමණක් නොව, ඒවායේ සායනික අදාළත්වය සහ චිකිත්සක විභවය සඳහා ය.මෙම POI දෙක සඳහා, සුප්‍රසිද්ධ බන්ධන හවුල්කරුවන් මෙන්ම ලියාපදිංචි නොකළ ඉලක්ක හඳුනා ගන්නා ලදී.සැලකිය යුතු ලෙස, අදියර වෙන් කිරීම ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් SFPQ සම-IP මගින් තහවුරු කරන ලදී, එය BRD4 (කෙටි සමස්ථානික) LLPS නියාමනය කරන නව යාන්ත්‍රණයක් පෙන්නුම් කරයි.ඒ අතරම, පාකින් උපස්ථර හඳුනා ගැනීම වක්ර මැලියම් හඳුනා ගැනීම අවශ්‍ය වන අවස්ථාවක් බව අපි විශ්වාස කරමු.අපි හඳුනා නොගත් පාකින් උපස්ථර දෙකක් හඳුනාගෙන ඒවා සර්වප්‍රකාර-ප්‍රෝටීසෝම මාර්ගය ඔස්සේ පිරිහීම තහවුරු කළෙමු.මෑතකදී, හයිඩ්‍රොලේස් උපස්ථර එන්සයිම මගින් හසුකර හඳුනාගැනීම සඳහා යාන්ත්‍රණය පදනම් කරගත් උගුල් උපාය මාර්ගයක් සකස් කර ඇත.මෙය ඉතා ප්‍රබල ක්‍රමයක් වුවද, විශාල සංකීර්ණ සෑදීමට සම්බන්ධ උපස්ථර විශ්ලේෂණය සඳහා සුදුසු නොවන අතර එන්සයිම සහ උපස්ථරය අතර සහසංයුජ බන්ධන සෑදීම අවශ්‍ය වේ.ඩියුබික්විටිනේස් සහ මෙටලෝප්‍රෝටේස් පවුල් වැනි අනෙකුත් ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ සහ එන්සයිම පවුල් අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා PDPL ව්‍යාප්ත කළ හැකි යැයි අපි අපේක්ෂා කරමු.
SOPP3 ලෙස හැඳින්වෙන miniSOG හි නව ආකාරයක් වැඩිදියුණු කරන ලද තනි ඔක්සිජන් නිෂ්පාදනය සමඟින් සංවර්ධනය කර ඇත.අපි SOPP3 සමඟ miniSOG සංසන්දනය කළ අතර සංඥා-ශබ්ද අනුපාතය නොවෙනස්ව පැවතියද, වැඩිදියුණු කළ ලකුණු කිරීමේ කාර්ය සාධනය සොයා ගත්තෙමු (පරිපූරක Fig. 11).SOPP3 ප්‍රශස්තිකරණය (උදා, අධ්‍යක්ෂණය කරන ලද පරිණාමය හරහා) කෙටි ආලෝක කාලයන් අවශ්‍ය වන වඩාත් කාර්යක්ෂම ප්‍රභාසංවේදක ප්‍රෝටීන වලට තුඩු දෙනු ඇතැයි අපි උපකල්පනය කළෙමු.සැලකිය යුතු ලෙස, PDPL හි වත්මන් අනුවාදය සෛලීය පරිසරයට සීමා වී ඇති බැවින් එයට නිල් ආලෝක ආලෝකය අවශ්‍ය වන අතර ගැඹුරු පටක වලට විනිවිද යාමට නොහැක.මෙම විශේෂාංගය සත්ව ආකෘති අධ්‍යයනයන්හි එය භාවිතා කිරීම වැළැක්විය හැකිය.කෙසේ වෙතත්, PDPL සමඟ දෘශ්‍ය ජාන සංකලනය, විශේෂයෙන් මොළයේ සත්ව පර්යේෂණ සඳහා අවස්ථාවක් ලබා දිය හැකිය.මීට අමතරව, අනෙකුත් ඉංජිනේරුමය අධෝරක්ත ඡායාරූප සංවේදීකාරක ද මෙම සීමාව ඉවත් කරයි.මෙම ප්රදේශයේ දැනට පර්යේෂණ සිදු වෙමින් පවතී.
HEK293T සෛල රේඛාව ATCC (CRL-3216) වෙතින් ලබා ගන්නා ලදී.සෛල රේඛාව මයිකොප්ලාස්මා ආසාදනය සඳහා සෘණාත්මකව පරීක්ෂා කරන ලද අතර DMEM (Thermo, #C11995500BT) හි 10% භ්‍රෑණ ගව මස්තු (FBS, Vistech, #SE100-B) සහ 1% පෙනිසිලින්/ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (Hyclone, #SV30010) සමඟ පරිපූරණය කරන ලදී.තුළ වර්ධනය වී ඇත.
3-Aminophenylene (නියැදිය 3) සහ (4-ethynylphenyl)මෙතනමයින් (නියැදි 4) Bidepharm වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී.Propylamine (පරීක්ෂණ 2) බලශක්ති-රසායන වලින් මිලදී ගන්නා ලදී.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) ප්‍රකාශිත ක්‍රමවලට අනුව සංස්ලේෂණය කරන ලදී.
පරිපූරක වගුව 1 මෙම අධ්‍යයනයේ භාවිතා කරන ජානමය නිර්මිතයන් ලැයිස්තුගත කරයි.miniSOG සහ KillerRed අනුපිළිවෙල P. Zou (Peking University) වෙතින් තෑගි ප්ලාස්මිඩයකින් ක්ලෝන කරන ලදී.මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් න්‍යාසය ඉලක්කගත අනුපිළිවෙල ව්‍යුත්පන්න කර ඇත්තේ COX4 හි N-පර්යන්ත ඇමයිනෝ අම්ල 23 කින් වන අතර Gibson එකලස් කිරීමක් භාවිතා කරමින් දක්වා ඇති දෛශික වලට ක්ලෝන කරන ලදී (Beyotime, #D7010S).එන්ඩොප්ලාස්මික් රෙටිකුලම් හි පටලය සහ න්‍යෂ්ටිය ඉලක්ක කර ගැනීම සඳහා, HEK293T සෛල cDNA පුස්තකාලයකින් PCR මගින් විස්තාරණය කරන ලද SEC61B මානව DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) සහ H2B DNA (D. Lin, Shen රසායනාගාරය විසින් පරිත්‍යාග කරන ලදී) සහ ඉහත සඳහන් කළ පරිදි ක්ලෝන කරන ලදී.වෙනත් ආකාරයකින් දක්වා නොමැති නම්, ස්ථායී සෛල රේඛා මාරු කිරීම සහ ගොඩනැගීම සඳහා භාවිතා කරන අනෙකුත් ප්‍රෝටීන් ජාන HEK293T සෛල cDNA පුස්තකාලයෙන් PCR වර්ධක කර ඇත.ඇමක් ප්‍රෝටීන් සහ miniSOG අතර සම්බන්ධක ලෙස G3S (GGGS) සහ G4S (GGGGS) භාවිතා කරන ලදී.V5 epitope tag (GKPIPNPLLGLDST) මෙම විලයන ඉදිකිරීම්වලට එක් කරන ලදී.ක්ෂීරපායීන්ගේ ප්‍රකාශනය සඳහා සහ ස්ථායී සෛල රේඛාවක් ස්ථාපිත කිරීම සඳහා, miniSOG විලයන නිර්මිතය pLX304 lentiviral දෛශිකයට උපක්ලෝන කරන ලදී.බැක්ටීරියා ප්‍රකාශනය සඳහා, miniSOG C-terminus හි 6xHis ලෙස ලේබල් කරන ලද pET21a දෛශිකයට ක්ලෝන කරන ලදී.
HEK293T සෛල ළිං හයක තහඩු තුළ ළිඳකට සෛල 2.0 x 105 බැගින් බීජ කර පැය 24කට පසුව ප්‍රතිසංයෝජක lentiviral ප්ලාස්මිඩ් (2.4 μg pLX304) සහ වෛරස් ඇසුරුම් ප්ලාස්මිඩ් (1.5 μg psPAX2 සහ 1.2po.G0μg භාවිතා කරමින් pBMDeG0μg) , #C0533), 80%ක් පමණ විලයනය.එක රැයකින් මාරු වීමෙන් පසුව, මාධ්යය වෙනස් කර තවත් පැය 24 ක් සඳහා පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කරන ලදී.වෛරසය එකතු කිරීම පැය 24, 48 සහ 72 කට පසුව සිදු කරන ලදී.ඉලක්කගත සෛල රේඛා ආසාදනය වීමට පෙර, වෛරස් මාධ්යය 0.8 μm පෙරහනක් (Merck, #millex-GP) හරහා පෙරන ලද අතර පොලිබ්‍රීන් (Solarbio, #H8761) 8 μg/ml සාන්ද්‍රණයකට එකතු කරන ලදී.පැය 24 කට පසු, මාධ්යය වෙනස් කිරීමෙන් සෛල නැවත යථා තත්ත්වයට පත් කිරීමට ඉඩ ලබා දෙන ලදී.අඩු දැඩි තේරීමක් ලෙස පළමු ඡේද තුන සඳහා 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) භාවිතා කරමින් සෛල තෝරා ගන්නා ලදී.ඊළඟ ඡේද තුන සඳහා වඩාත් දැඩි පිළිවෙතක් ලෙස 20 μg/ml භාවිතා කරන ලදී.
සෛල ළිං කුටි 12 ක (Ibidi, #81201) ළිඳකට සෛල 20,000 ක ඝනත්වයකින් බීජ කරන ලදී.HEK293T සෛල ඇලවීම වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා, 37 ° C දී පොස්පේට් බෆරඩ් සේලයින් (PBS, Sangon, #B640435) තනුක කළ 50 µg/ml ෆයිබ්‍රොනෙක්ටින් (කෝනිං, #356008) එකතු කරන්න.කුටීර පැය 1ක් පෙරාතුව පසුව PBS මගින් ඉවත් කරන ලදී.පැය 24 කට පසු, සෛල PBS සමඟ එක් වරක් සෝදා, නැවුම් Hanks හි සමතුලිත ලුණු ද්‍රාවණයේ (HBSS, Gibco, #14025092) 37 ° C දී පැය 1 ක් සඳහා 1 mM ප්‍රොබ් 3 සමඟ පුර්වීකරණය කරන ලද අතර පසුව නිල් LED (460 nm) සමඟ පුර්වකාශනය කරන ලදී. )) කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 10 ක් විකිරණය කරන ලදී.ඊට පසු, සෛල PBS සමඟ දෙවරක් සෝදා, කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 15 ක් සඳහා PBS (Sangon, #E672002) හි 4% formaldehyde සමඟ සවි කර ඇත.PBS සමඟ තුන් වරක් සේදීමෙන් අතිරික්ත formaldehyde ස්ථාවර සෛල වලින් ඉවත් කරන ලදී.පසුව PBS හි 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) සමඟ සෛල පාරගම්ය කර PBS සමඟ 3 වරක් සෝදා ඇත.ඉන්පසු කුටිය ඉවත් කර 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) අඩංගු ක්ලික් ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණයක 25 µl සාම්පලයකට එක් කරන්න. සහ 0.5 mg/ml සෝඩියම් ඇස්කෝර්බේට් (Aladdin, no. S105024) සහ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් සඳහා පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කර ඇත.ක්ෂණික ප්‍රතික්‍රියාවකින් පසු, සෛල 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) අඩංගු PBS සමඟ හය වතාවක් සෝදා, පසුව කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 30ක් සඳහා PBST හි 5% BSA (Abcone, #B24726) සමඟ අවහිර කරන ලදී.
Colocalization immunostaining සඳහා, සඳහන් කර ඇති කොන්දේසිවලට අනුව සෛල ප්‍රාථමික ප්රතිදේහ සමඟ පුර්වගත කරන ලදී: mouse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), rabbit anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), රැබිට් පොලික්ලෝනල් ප්‍රති-කැල්නෙක්සින් ප්රතිදේහ (1:500, ඇබ්කාම්, #ab22595) හෝ හාවා ප්‍රති-ලැමින් A/C මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (1:500; CST, #2032) එක රැයකින් 4 °C.PBST සමඟ 3 වතාවක් සේදීමෙන් පසු, සෛල ද්විතියික ප්රතිදේහ සමඟ පුර්වගත කරන ලදී: එළු-හාවා-විරෝධී ඇලෙක්සා ෆ්ලෝවර් 488 (තර්මෝ, #A11034) 1:1000 තනුක, එළු ප්‍රති-මූසික Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 0001 තනුක කර ඇත.තනුක විනාඩි 30 ක් සඳහා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී තනුක.පසුව සෛල PBST සමඟ 3 වරක් සෝදා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 10 ක් සඳහා PBS හි DAPI (Thermo, #D1306) සමඟ ප්රතිවිරෝධී විය.PBS සමඟින් 3 සේදීමෙන් පසුව, සෛල රූපගත කිරීම සඳහා PBS හි 50% glycerol (Sangon, #A600232) තුළ මුද්‍රා තබන ලදී.ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal අන්වීක්ෂයක් සහ ZNE 3.5 මෘදුකාංගයක් භාවිතයෙන් Immunofluorescent රූප ලබා ගන්නා ලදී.
තනි ඔක්සිජන් ප්‍රතිදීප්ත රූපකරණය සඳහා, Hanks HEPES බෆරයේ 100 nM Si-DMA එකතු කිරීමට පෙර (DOJINDO, #MT05) සෛල Hanks HEPES බෆරයෙන් දෙවරක් සෝදා ඇත.ආලෝකයට නිරාවරණය වීමෙන් පසුව, සෛල CO2 ඉන්කියුබේටරයක 37 ° C දී විනාඩි 45 ක් සඳහා ඉන්කියුබේට් කර ඇත.ඉන්පසුව සෛල Hanks HEPES බෆරයෙන් දෙවරක් සෝදා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 10ක් සඳහා Hanks HEPES බෆරයේ Hoechst සමඟ ප්‍රති-පැල්ලම් කර ZEISS LSM 900 confocal අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් දෘශ්‍යකරණය කරන ලදී., #M36008) කැල්සියම් සහ මැග්නීසියම් අඩංගු HBSS බෆරයේ.ආලෝකයට හෝ ඩොක්සොරුබිසින්ට (MCE, #HY-15142A) නිරාවරණය වීමෙන් පසුව, සෛල CO2 ඉන්කියුබේටරයක 37° C. විනාඩි 10ක් පුර්වගත කර, HBSS බෆරයෙන් දෙවරක් සෝදා, කාමර උෂ්ණත්වයේ දී HBSS බෆරයේ Hoechst සමඟ පුර්වකාශනය කරන ලදී.මිනිත්තු.මිනිත්තු 30ක් සඳහා 1% BSA අඩංගු HBSS හි 20 μM doxorubicin සමඟ සෛල ප්රතිකාර කරන ලද ධනාත්මක පරීක්ෂණ පාලනයක් ලෙස Doxorubicin භාවිතා කරන ලදී.Zeiss LSM 900 confocal අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් Immunofluorescent රූප ලබා ගන්නා ලදී.
HEK293T සෛල ස්ථායීව mito-miniSOG ප්‍රකාශ කිරීම සෙන්ටිමීටර 15 ක දීසිවල දළ වශයෙන් 30% ක ඝනත්වයකින් බීජ කරන ලදී.පැය 48කට පසු, ~80% සමුහයට ළඟා වූ විට, සෛල PBS සමඟ එක් වරක් සෝදා, 1 mM Probe 3 සමඟ නැවුම් HBSS බෆරයක පැය 1ක් 37°C දී ඉන්කියුබ් කර පසුව කාමරයේ විනාඩි 10ක් නිල් LED එකකින් ආලෝකමත් කරන ලදී. උෂ්ණත්වය..ඉන්පසුව, සෛල PBS සමඟ දෙවරක් සෝදා, EDTA-නිදහස් ප්‍රෝටීස් නිෂේධක (MCE, #HY-K0011) අඩංගු අයිස්-සීතල PBS බෆරය තුළ සීරීමට සහ නැවත සවි කරන ලදී.මිනිත්තු 1ක් (තත්පර 1ක් සහ 35% විස්තාරයකදී තත්පර 1ක් අඩුවෙන්) තුඩය ශබ්ද කිරීම මගින් සෛල ලයිස් කරන ලදී.එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස මිශ්‍රණය සුන්බුන් ඉවත් කිරීම සඳහා 4 ° C දී විනාඩි 10 ක් සඳහා 15,871 xg ට කේන්ද්රාපසාරී කරන ලද අතර, BCA ප්‍රෝටීන් තක්සේරු කට්ටලයක් (Beyotime, #P0009) භාවිතයෙන් සුපිරි සාන්ද්‍රණය 4 mg/mL ලෙස සකස් කරන ලදී.ඉහත ලයිසේට් මිලිලීටර 1ක් 0.1 mM ප්‍රකාශ වියෝජනය කළ හැකි biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437) සහ පහළ mcubator 1 mcubator සමඟ ඒකාබද්ධ කරන්න. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් දක්වා භ්රමණය.ක්ෂණික ප්‍රතික්‍රියාවකින් පසු, මිශ්‍රණය පෙර මිශ්ර ද්‍රාවණයට (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) මිලි ලීටර් 10 වීදුරු කුප්පියකට එක් කරන්න.සාම්පල මිශ්ර කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 10 ක් ග්රෑම් 4500 ක කේන්ද්රාපසාරී කර ඇත.පහළ සහ ඉහළ ද්‍රාවණ ඉවත දමන ලද අතර, වර්ෂාපතනය මෙතනෝල් මිලි ලීටර් 1 කින් දෙවරක් සෝදා 4 ° C දී විනාඩි 5 ක් 15871 × g දී කේන්ද්රාපසාරී කරන ලදී.වර්ෂාපතනය විසුරුවා හැරීම සඳහා 25 mM ඇමෝනියම් බයිකාබනේට් (ABC, ඇලඩින්, අංක A110539) තුළ 8 M යූරියා (ඇලඩින්, අංක U111902) මිලි ලීටර් 1 ක් එකතු කරන්න.සාම්පල 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) සමඟ විනාඩි 40ක් 55°C දී ප්‍රතිසංවිධානය කරන ලද අතර පසුව අඳුරේ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී 15 mM නැවුම් iodoacetamide (Sangon, #A600539) එකතු කරන ලදී.මිනිත්තු 30 ක් ඇතුළත ඇල්කයිලීකරණය..ප්රතික්රියාව නැවැත්වීම සඳහා අතිරේක 5 mM dithiothreitol එකතු කරන ලදී.එක් එක් නියැදිය සඳහා ආසන්න වශයෙන් 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) 1 ml PBS සමඟ 3 වරක් සේදීමෙන් පිළියෙළ කරන්න.ඉහත ප්‍රෝටියෝම් ද්‍රාවණය මිලිලීටර් 5 PBS සමඟ තනුක කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 4ක් පෙර සෝදාගත් NeutrAvidin agarose beads සමඟ පුර්ව ගන්වන ලදී.පසුව පබළු 0.2% SDS (Sangon, #A600485) අඩංගු 5 ml PBS වලින් 3 වතාවක්, යූරියා 1M අඩංගු PBS 5 ml සමඟ 3 වතාවක් සහ 5 ml ddH2O සමඟ 3 වතාවක් සෝදා ඇත.පබළු පසුව කේන්ද්රාපසාරී මගින් අස්වනු නෙළන ලද අතර 1 M යූරියා, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) සහ 20 ng/μl ට්‍රයිප්සින් (Promega, #V5280) අඩංගු 25 mM ABC හි 200 μl හි නැවත ලබා දෙන ලදී.භ්රමණය සමඟ 37 ° C දී එක රැයකින් ට්‍රිප්සිනයිස් කරන්න.pH අගය 2-3 දක්වා ළඟා වන තෙක් ෆෝමික් අම්ලය (Thermo, # A117-50) එකතු කිරීමෙන් ප්රතික්රියාව නතර විය.පබළු 0.2% SDS අඩංගු PBS මිලි ලීටර් 1 කින් 3 වතාවක්, යූරියා 1 M යූරියා අඩංගු PBS මිලි ලීටර් 1 ක් සමඟ 3 වතාවක් සහ ආස්රැත ජලය මිලි ලීටර් 1 කින් 3 වතාවක් සෝදා ඇත.නවීකරණය කරන ලද පෙප්ටයිඩ 70% MeOH හි 200 μl භාවිතා කරමින් මිනිත්තු 90 ක් සඳහා සැහැල්ලු ලිසිස් (365 nm) මගින් මුදා හරින ලදී.කේන්ද්රාපසාරී කිරීමෙන් පසුව, අධිප්රමාණ එකතු කරන ලදී.ඉන්පසුව පබළු 70% MeOH 100 μl සමඟ වරක් සෝදා ඇති අතර සුපිරිසිදු ද්‍රව්‍ය එකතු කරන ලදී.නියැදි Speedvac රික්ත සාන්ද්‍රණයක වියළා විශ්ලේෂණය කරන තෙක් -20 ° C දී ගබඩා කර ඇත.
තනි ඔක්සිජන් වෙනස් කරන ලද පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගැනීමට සහ ප්‍රමාණ කිරීමට, සාම්පල 0.1% ෆෝමික් අම්ලයේ නැවත විසුරුවා හරින ලද අතර 1 μg පෙප්ටයිඩ විශ්ලේෂණ කරන ලද්දේ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් භාවිතා කර Tune සහ Xcalibur වෙතින් නැනෝ ESI ප්‍රභවයකින් සමන්විත වේ.3 µm C18 ද්‍රව්‍ය (ReproSil-pur, #r13.b9.) සමඟ අභ්‍යන්තරව ඇසුරුම් කරන ලද 75 µm × 15 cm කේශනාලිකා තීරුවක් මත සාම්පල වෙන් කර EASY-nLC 1200 UHPLC පද්ධතියකට (Thermo) සම්බන්ධ කරන ලදී.පෙප්ටයිඩ 8% ද්‍රාවක B සිට 50% ද්‍රාවක B දක්වා රේඛීය මිනිත්තු 95 ශ්‍රේණියේ වර්ණදේහ මගින් වෙන් කරන ලදී (A = 0.1% ෆෝමික් අම්ලය ජලයේ, B = 0.1% ෆෝමික් අම්ලය 80% ඇසිටොනයිට්‍රයිල්), පසුව රේඛීයව 98% B විනාඩි දක්වා වැඩි කරන ලදී. මිනිත්තු 6 කින් 300 nl / min ප්රවාහ අනුපාතයකින්.Orbitrap Fusion Lumos දත්ත මත පදනම්ව සම්පූර්ණ MS ස්කෑන් සහ MS2 ස්කෑන් අතර මාරුවෙන් මාරුවට දත්ත රැස් කරයි.ස්පුටරින් වෝල්ටීයතාව 2.1 kV ලෙස සකසා ඇති අතර අයන පරිවහන කේශනාලිකා උෂ්ණත්වය 320 ° C වේ.MS වර්ණාවලි (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, සහ උපරිම ආදාන කාලය 150 ms සමඟ එකතු කරන ලදී.සෑම සම්පූර්ණ ස්කෑන් එකකම වඩාත් සුලභ ගුණිත ආරෝපිත පූර්වගාමීන් 10, 30% ක සාමාන්‍ය ඝට්ටන ශක්තියක්, 1.6 m/z ක චතුරශ්‍ර හුදකලා කවුළුවක් සහ 30,000 ක විභේදන සැකසුමකින් HCD භාවිතයෙන් ඛණ්ඩනය කරන ලදී.5×104 භාවිතා කරමින් ටැන්ඩම් ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය සඳහා AGC ඉලක්කයක් සහ උපරිම ආදාන කාලය 150 ms.ගතික ව්යතිරේකය තත්පර 30 ට සකසා ඇත. MS/MS සඳහා පවරන ලද අයන හෝ 1+ සහ >7+ ආරෝපණයක් සහිත අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී. MS/MS සඳහා පවරන ලද අයන හෝ 1+ සහ >7+ ආරෝපණයක් සහිත අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී. Неназначеные ионы или ионы с зарадом 1+ සහ >7+ බ්ලි ඔට්ක්ලෝනින් දක්වා එම්එස්/එම්එස්. MS/MS සඳහා 1+ සහ >7+ ආරෝපණයක් සහිත පවරන ලද අයන හෝ අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ සහ >7+ බ්ලයි ඔට්ක්ලෝනින් දක්වා එම්එස්/එම්එස්. MS/MS සඳහා 1+ සහ >7+ ආරෝපණ සහිත නිශ්චිත නොවන අයන හෝ අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී.
MSFragger මත පදනම් වූ FragPipe පරිගණක වේදිකාව භාවිතයෙන් අමු දත්ත සකසනු ලැබේ.-150 සිට 500 Da දක්වා පූර්වගාමී ස්කන්ධ ඉවසීමක් සහිත විවෘත සෙවුම් ඇල්ගොරිතමයක් භාවිතයෙන් ස්කන්ධ පක්ෂග්‍රාහී සහ අනුරූප ඇමයිනෝ අම්ල නිර්ණය කරන ලදී.පසුව PD හි +229.0964 සහ +247.1069 Da (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) ස්කන්ධ ලාභයන් සහිත හිස්ටයිඩින් වෙනස් කිරීම් භාවිතයෙන් නවීකරණය කරන ලද පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගන්නා ලදී.
විලයනය වූ miniSOG ජානය ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරන සෛල සෙන්ටිමීටර 6 ක පිඟන් වල ආලේප කර ඇත.~80% සමුහයට ළඟා වූ පසු, සෛල HBSS (Gibco, #14025092) සමඟ එක් වරක් සෝදා, පසුව 37 ° C දී පැය 1 ක් සඳහා HBSS හි රසායනික පිරික්සුම් සමඟ පුර්වීකරණය කර නිල් ආලෝකයෙන් ආලෝකමත් කරන ලදී.කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 20 ක් සඳහා 10W LED.PDPL හි කුමන ආකාරයේ ප්‍රතික්‍රියාශීලී ඔක්සිජන් විශේෂයක් සම්බන්ධ දැයි තීරණය කිරීමට, 0.5 mM විටමින් C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 අතිරේක ලෙස සෛල වලට එකතු කරන ලදී.සීතල PBS සමඟ සේදීමෙන් පසු, සෛල සීරීමට ලක් කර, 1.5 ml කේන්ද්රාපසාරී නලවල එකතු කර, EDTA නොමැතිව 1x ප්‍රෝටීස් නිෂේධකය සමඟ PBS 200 μl තුළ මිනිත්තු 1 ක් සඳහා ඉඟියක් සමඟ සොනික් කරන ලදී (1 s සහ 1 s තොරව, විස්තාරය 35%).එහි ප්‍රතිඵලයක් ලෙස මිශ්‍රණය විනාඩි 10ක් 4 °C දී 15,871 × g ට කේන්ද්රාපසාරී කරන ලද අතර BCA ප්‍රෝටීන් විශ්ලේෂණ කට්ටලයක් භාවිතයෙන් සුපිරි සාන්ද්‍රණය 1 mg/mL ලෙස සකස් කරන ලදී.ඉහත ලයිසේට් වලින් ආසන්න වශයෙන් 50 µl 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, සහ 1 mM CuSO4 සමඟ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පහළ සිට ඉහළට භ්රමණය වන පරිදි පැය 1 ක් පුර්වගත කරන ලදී.ක්ලික් ප්‍රතික්‍රියාවෙන් පසු, ඇසිටෝන් සමඟ වර්ෂාපතනය සිදු කරනු ලැබුවේ සාම්පලවලට පෙර-සිසිල් කළ ඇසිටෝන් 250 μl එකතු කිරීමෙනි, මිනිත්තු 20 ක් සඳහා -20 ° C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම සහ 4 ° C දී විනාඩි 10 ක් සඳහා 6010×g දී කේන්ද්රාපසාරී කිරීම.පෙති එකතු කර 50 µl 1x Laemmli බෆරයේ විනාඩි 10 ක් 95 ° C උනු.නියැදි පසුව SDS-PAGE දිගු ජෙල් මත විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර Image Lab Touch මෘදුකාංගය සමඟ Bio-rad ChemiDoc MP Touch රූපකරණ පද්ධතිය භාවිතයෙන් දෘශ්‍යකරණය කරන ලදී.
ප්‍රතිසංයෝජන miniSOG-6xHis ප්‍රෝටීනයේ ප්‍රකාශනය සහ පිරිසිදු කිරීම කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි සිදු කරන ලදී.කෙටියෙන්, E. coli BL21(DE3) සෛල (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis සමඟින් පරිවර්තනය කරන ලද අතර ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනය 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) සමඟ ප්‍රේරණය විය.සෛල විනාශයෙන් පසුව, ප්‍රෝටීන Ni-NTA agarose beads (MCE, අංක 70666) භාවිතයෙන් පිරිසිදු කර, PBS වලට එරෙහිව ඩයල් කර, සහ –80°C දී ගබඩා කර ඇත.
ප්රතිදේහ මත පදනම් වූ in vitro ලේබල් සමීපතා තක්සේරුවක් සඳහා, PBS හි 100 μM පිරිසිදු කළ miniSOG, 1 mM probe 3, සහ 1 μg ප්‍රති-ලේබල් mouse monoclonal ප්රතිදේහ (TransGen, #HT501-01) සම්පූර්ණ ප්‍රතික්‍රියා පරිමාව 50 μl වෙත මිශ්ර කරන්න..ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 0, 2, 5, 10 සහ 20 සඳහා නිල් LED ආලෝකයෙන් විකිරණය කරන ලදී.මෙම මිශ්‍රණය 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, සහ 1 mM CuSO4 සමඟ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ඉහළට චලන ෂේකර් මත පැය 1 ක් සඳහා පුර්වගත කරන ලදී.ක්ෂණික ප්‍රතික්‍රියාවකින් පසු, 4x Laemmli's buffer එක කෙලින්ම මිශ්‍රණයට එකතු කර 95°C දී විනාඩි 10ක් උනු.SDS-PAGE ජෙල් මත සාම්පල විශ්ලේෂණය කර streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) සමඟ බටහිර බ්ලොටින් මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) සහිත හිස්ටයිඩින් අඩංගු කෘතිම පෙප්ටයිඩයක් අසල ඇති පෙප්ටයිඩ මත පදනම් වීට්‍රෝ ලේබල් කිරීම විශ්ලේෂණය කිරීමට භාවිතා කරන ලදී.මෙම විශ්ලේෂණයේදී, 100 μM පිරිසිදු miniSOG, 10 mM probe 3 සහ 2 μg/ml කෘතිම පෙප්ටයිඩ PBS හි 50 μl හි සම්පූර්ණ ප්‍රතික්‍රියා පරිමාවකින් මිශ්ර කරන ලදී.ප්‍රතික්‍රියා මිශ්‍රණය කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් නිල් LED ආලෝකයෙන් විකිරණය කරන ලදී.LC-MS පද්ධතියක් (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight Mass Spectrometer සමඟ MassLynx වර්ණාවලීක්ෂ විශ්ලේෂණ මෘදුකාංගයක්) භාවිතයෙන් එක් මයික්‍රොලීටර සාම්පලයක් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
miniSOG විලයන ජානය ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරන HEK293T සෛල විවිධ ඉන්ද්‍රිය ප්‍රාදේශීයකරණය (Mito, ER, Nucleus) සහිත රේඛා සඳහා සෙ.මී. 10 පිඟන්වල සහ Parkin-miniSOG සහ BRD4-miniSOG රේඛා සඳහා සෙ.මී.~90% සමුහයට ළඟා වූ පසු, සෛල HBSS සමඟ එක් වරක් සෝදා, පසුව 37 ° C දී පැය 1 ක් සඳහා HBSS හි probe 3 සමඟ ඉන්කියුබ් කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී 10 W නිල් LED එකකින් ආලෝකමත් කරන ලදී.පාකින් ස්පර්ශ නොවන ලේබල් කිරීම සඳහා, 10 µM ප්‍රෝටෝන කාබොනයිල් සයනයිඩ් වාහක m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) HBSS හි විමර්ශන 3 සමඟ 37 ° C දී පැය 1 ක් සඳහා එකතු කරන ලදී.සෛල විඛාදනය, ක්ලික් රසායන විද්යාව, අඩු කිරීම සහ ඇල්කයිලේෂන් පියවර ඉහත විස්තර කර ඇති ආකාරයටම විය, ලයිසේට් මිලිග්‍රෑම් 2 ක් එකතු කර ඇති අතර ක්ලික් ප්‍රතික්‍රියාවේදී ෆොටෝඩිග්‍රේඩබල් බයෝටින් ඇසයිඩ් වෙනුවට බයෝටින් පීඊජී 3 ඇසයිඩ් භාවිතා කරන ලදී.සාරවත් කිරීමෙන් පසු, පබළු 0.2% SDS අඩංගු PBS 5 ml සමඟ 3 වතාවක්, 1 M යූරියා අඩංගු PBS 5 ml සමඟ 3 වතාවක් සහ PBS 5 ml සමඟ 3 වතාවක් සෝදා ඇත.ඉන්පසුව, යූරියා 1 M අඩංගු 300 µl 25 mM ABC වෙත ට්‍රයිප්සින් 2 µg එකතු කරන ලද අතර එය එක රැයකින් 37 ° C දී ප්‍රෝටීන් කැඩී යයි.pH අගය 2-3 දක්වා ළඟා වන තුරු ෆෝමික් අම්ලය එකතු කිරීමෙන් ප්රතික්රියාව නතර විය.පබළු මත ට්‍රයිප්සිනීකරණය කිරීමෙන් පසුව, පෙප්ටයිඩ ද්‍රාවණය SOLAµ HRP තීරුවක් (Thermo, #60209-001) භාවිතයෙන් ඉවත් කර Speedvac රික්ත සාන්ද්‍රණයක වියළන ලදී.පෙප්ටයිඩ 0.1% ෆෝමික් අම්ලය තුළ නැවත විසුරුවා හරින ලද අතර ඉහත විස්තර කර ඇති නැනෝ-ඊඑස්අයි ප්‍රභවයෙන් සමන්විත Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂයක් භාවිතයෙන් පෙප්ටයිඩ 500 ng විශ්ලේෂණය කරන ලදී.වාණිජ RP-HPLC පූර්ව තීරු (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) සහ විශ්ලේෂණ RP-HPLC තීරු (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941) මත පෙප්ටයිඩ වෙන් කරන ලදී, දෙකම 2 μm පුරවා ඇත.මිනිත්තු 60 කින් 8% සිට 35% ACN දක්වා අනුක්‍රමණය, පසුව 300 Nl/min ප්රවාහ අනුපාතයකින් මිනිත්තු 6 කින් රේඛීයව 98% B දක්වා වැඩි විය.MS වර්ණාවලි (350-1500 m/z) 60,000, AGC 4 × 105, සහ උපරිම ආදාන කාලය 50 ms සමඟින් එකතු කරන ලදී.තෝරාගත් අයන 30% ක සාමාන්‍ය ඝට්ටන ශක්තියක්, 1.6 m/z quadrupole හුදකලා කවුළුවක් සහ 15000 ක විභේදනයක් සහිත 3 s චක්‍රවල HCD මගින් අනුක්‍රමිකව ඛණ්ඩනය කරන ලදී. A 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC ඉලක්කය සහ උපරිම වශයෙන් 22 ms භාවිතා කරන ලදී.ගතික බැහැර කිරීම තත්පර 45 ට සකසා ඇත. MS/MS සඳහා පවරන ලද අයන හෝ 1+ සහ >7+ ආරෝපණයක් සහිත අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී. MS/MS සඳහා පවරන ලද අයන හෝ 1+ සහ >7+ ආරෝපණයක් සහිත අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී. Неназначеные ионы или ионы с зарадом 1+ සහ >7+ බ්ලි ඔට්ක්ලෝනින් දක්වා එම්එස්/එම්එස්. MS/MS සඳහා 1+ සහ >7+ ආරෝපණයක් සහිත පවරන ලද අයන හෝ අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ සහ >7+ බ්ලයි ඔට්ක්ලෝනින් දක්වා එම්එස්/එම්එස්. MS/MS සඳහා 1+ සහ >7+ ආරෝපණ සහිත නිශ්චිත නොවන අයන හෝ අයන ප්‍රතික්ෂේප කරන ලදී.
NeutrAvidin පබළු සුපෝෂණය කිරීම දක්වා නියැදි සකස් කිරීමේ පියවර ඉහත විස්තර කර ඇති LC-MS/MS විශ්ලේෂණයට සමාන විය.පැටවුම් පාලනය සඳහා ආදානය ලෙස ලයිසේට් 50 μg පමණ භාවිතා කරන ලද අතර ක්ලික් ප්‍රතික්‍රියා සඳහා 2 mg ලයිසේට් භාවිතා කරන ලදී.නියුට්‍රාවිඩින් සමඟ සාරවත් කර සේදීමෙන් පසු, ඇගරෝස් ෙරසින් පබළුවලට 50 μl ලෙම්ම්ලි බෆරය එකතු කර විනාඩි 5 ක් 95 ° C. තාපාංක කිරීමෙන් බැඳුනු ප්‍රෝටීන ඉවත් කරන ලදී.පාලන භාර ආදානය සහ පබළු පොහොසත් සාම්පල SDS-PAGE මගින් විශ්ලේෂණය කර සම්මත වෙස්ටර්න් බ්ලොට් ක්‍රම මගින් PVDF පටල (Millipore, #ISEQ00010) වෙත මාරු කරන ලදී.0.1% tween-20 (TBST) අඩංගු TBS හි 5% මුදවපු කිරි (Sangon, #A600669) සමඟ පටල අවහිර කරන ලද අතර ප්‍රාථමික සහ ද්විතියික ප්රතිදේහ සමඟ අනුක්‍රමිකව පුර්වගත කරන ලදී.ප්‍රාථමික ප්රතිදේහ TBST හි 5% මුදවපු කිරි වල 1:1000 තනුක කර 4 ° C දී එක රැයකින් පුර්වාගත කරන ලදී.ද්විතීයික ප්රතිදේහ 1: 5000 අනුපාතයකින් භාවිතා කරන ලද අතර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් සඳහා ඉන්කියුටේෂන් කර ඇත.Chemidoc MP ප්‍රතිරූපණ ක්‍රමය භාවිතා කරමින් Chemiluminescence මගින් පටල දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.රූපයේ ඇති බ්ලොට් සහ ජෙල් වල නොකැපූ සියලුම ස්කෑන් අමු දත්ත ලෙස ඉදිරිපත් කෙරේ.
මෙම අධ්‍යයනයේ භාවිතා කරන ලද ප්‍රාථමික ප්රතිදේහ අතර හාවා විරෝධී SFPQ මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (CST, අංක 71992), හාවා විරෝධී FUS මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (CST, අංක 67840), හාවා විරෝධී NSUN2 බහු ක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (Proteintech, අංක 20854-1-1- AP), හාවා විරෝධී mSin3A බහු ක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (Abcam, #ab3479), මූසික ප්‍රති-ටැග් මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (TransGen, #HT201-02), මූසික ප්‍රති-β-ඇක්ටින් මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (TransGen, #HC201-01), හාවා ප්රතිදේහ -CDK2 මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (ABclonal, #A0094), හාවා මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ CTBP1 (ABclonal, #A11600), DUT වෙත හාවා බහු ක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (ABclonal, #A2901), PSMC4 වෙත හාවා බහු ක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (ABclonal, #A250) DNAJB1 බහු ක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (ABclonal, # A5504).මෙම ප්රතිදේහ TBST හි 5% මුදවපු කිරි වල 1:1000 තනුක කිරීමේදී භාවිතා කරන ලදී.මෙම අධ්‍යයනයේ දී භාවිතා කරන ලද ද්විතියික ප්රතිදේහ වලට 1:5000 තනුක කිරීමේ දී හාවා-විරෝධී IgG (TransGen, #HS101-01), මූසික විරෝධී IgG (TransGen, #HS201-01) ඇතුළත් විය.
BRD4 SFPQ සමඟ අන්තර්ක්රියා කරන්නේද යන්න තවදුරටත් විමර්ශනය කිරීම සඳහා, ස්ථායී HEK293T සහ BRD4-miniSOG සෛල HEK293T අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන ලද සෙ.මී.සෛල සීතල PBS වලින් සෝදා මිලිලීටර් 1ක Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) EDTA රහිත protease inhibitor සමඟ විනාඩි 30ක් 4°C ට ලයිස් කරන ලදී.ඊට පසු, ලයිසේට් මිලි ලීටර් 1.5 ක කේන්ද්රාපසාරී නලවල එකතු කර 4 ° C දී විනාඩි 10 ක් සඳහා 15,871 xg කේන්ද්රාපසාරී කරන ලදී.අධි ප්‍රනාල ද්‍රව්‍ය අස්වනු නෙළා ගෙන ප්‍රති-V5 ලේබල් කරන ලද මවුස් මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (CST, #80076) 5 µg සමඟ එක රැයකින් 4°C ට ඉන්කිබියුට් කරන ලදී.ප්‍රෝටීන් A/G චුම්බක පබළු 50 µl (MCE, #HY-K0202) 0.5% Tween-20 අඩංගු PBS සමඟ දෙවරක් සෝදන්න.එවිට සෛල ලයිසේට් පහළ සිට ඉහළට භ්රමණය වීමත් සමඟ 4 ° C දී පැය 4 ක් චුම්බක පබළු සමඟ පුර්වීකරණය කරන ලදී.ඉන්පසුව පබළු PBST බෆරයේ මිලි ලීටර් 1 කින් හතර වතාවක් සෝදා විනාඩි 5 ක් සඳහා 95 ° C උනු.සාම්පල SDS-PAGE ජෙල් මත විශ්ලේෂණය කර සම්මත වෙස්ටර්න් බ්ලොට් ක්‍රම භාවිතයෙන් PVDF පටල වෙත මාරු කරන ලදී.TBST හි 5% මුදවපු කිරි වල පටල අවහිර කර ඇති අතර ප්‍රාථමික සහ ද්විතියික ප්රතිදේහ සමඟ අනුක්‍රමිකව පුර්වගත කරන ලදී.ප්‍රාථමික ප්රතිදේහ රැබිට් ප්‍රති-SFPQ මොනොක්ලෝනල් ප්රතිදේහ (CST, #71992) TBST හි 5% මුදවපු කිරිවල 1:1000 අනුපාතයකින් භාවිතා කරන ලද අතර 4 ° C දී එක රැයකින් පුර්වකාශනය කරන ලදී.Anti-rabbit IgG 1: 5000 අනුපාතයකින් භාවිතා කරන ලද අතර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් සඳහා පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කරන ලදී.Chemidoc MP ප්‍රතිරූපණ ක්‍රමය භාවිතා කරමින් Chemiluminescence මගින් පටල දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.
Solvent Accessible Surface Area (SASA) විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන සියලුම ව්‍යුහයන් ප්‍රෝටීන් දත්ත බැංකුව (PDB)52 හෝ AlphaFold Protein Structure Database53 වෙතින් ලබාගෙන ඇත.FreeSASA වැඩසටහන භාවිතයෙන් එක් එක් අවශේෂ සඳහා නිරපේක්ෂ SASA ගණනය කරන ලදී.එක් එක් ව්යුහය සඳහා මධ්යන්ය SASA ලබා ගැනීම සඳහා භාවිතා කරන ලද්දේ ලේබල් කරන ලද histidine සහ එහි අසල්වැසියන් සඳහා වන සම්පූර්ණ සහ නොපැහැදිලි SASA දත්ත පමණි.එක් එක් histidine සඳහා සාපේක්ෂ ද්‍රාවක ප්‍රවේශ්‍යතාව (RSA) ගණනය කරනු ලැබුවේ ද්‍රාවකයට ලබා ගත හැකි ආනුභවික උපරිම අපද්‍රව්‍ය මතුපිට ප්‍රදේශයෙන් නිරපේක්ෂ SASA අගය බෙදීමෙනි.මධ්යන්ය RSA 20% ට වඩා අඩු නම්, එසේ නොමැති නම් නිරාවරණය වූ විට සියලුම histidines සැඟවුණු ලෙස වර්ගීකරණය කරන ලදී.
DDA ප්‍රකාරයේදී ලබාගත් අමු ගොනු ප්‍රෝටියෝම් ඩිස්කවර් (v2.5) හෝ MSfragger (Fragpipe v15.0) භාවිතයෙන් සාමාන්‍ය දූෂිත ද්‍රව්‍ය අඩංගු සුදුසු SwissProt සත්‍යාපිත ප්‍රෝටීන් දත්ත ගබඩාවේ සෙවුම් කරන ලදී.පෙප්ටයිඩ සඳහා සම්පූර්ණ ට්‍රයිප්සින් අවශ්‍ය වූයේ නැති වූ බෙදුම් ස්ථාන දෙකක්, ස්ථාවර වෙනස් කිරීමක් ලෙස කාබමොයිල් මෙතිලේෂන් සහ ගතික වෙනස් කිරීමක් ලෙස මෙතියොනීන් ඔක්සිකරණය.පූර්වගාමියා සහ කොටස් බර ඉවසීම පිළිවෙලින් 10 ppm සහ 0.02 Da (MS2 Orbitrap) ලෙස සකසා ඇත. දූෂිත පහරවල් ඉවත් කරන ලද අතර, <1% ක ව්‍යාජ සොයාගැනීම් අනුපාතයක් ලබා ගැනීම සඳහා ප්‍රෝටීන පෙරීම සිදු කරන ලදී. දූෂිත පහරවල් ඉවත් කරන ලද අතර, <1% ක ව්‍යාජ සොයාගැනීම් අනුපාතයක් ලබා ගැනීම සඳහා ප්‍රෝටීන පෙරීම සිදු කරන ලදී. <සා.පෙළ> දූෂිත පහරවල් ඉවත් කර <1%ක ව්‍යාජ හඳුනාගැනීමේ අනුපාතයක් ලබා දීම සඳහා ප්‍රෝටීන පෙරන ලදී.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ били удалены, а белки отфильтрованы для для достижения уровня 1% <1% ක ව්‍යාජ ධනාත්මක අනුපාතයක් ලබා ගැනීම සඳහා දූෂිත පහර ඉවත් කර ප්‍රෝටීන පෙරීම සිදු කරන ලදී.ලේබල් භාවිතයෙන් තොරව ප්‍රමාණාත්මක විශ්ලේෂණය සඳහා, ජීව විද්‍යාත්මක පුනරාවර්තන තුනකින් සාමාන්‍යකරණය වූ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ගතය භාවිතා කරන ලදී.DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 වෙතින් Gene Ontology (GO) විශ්ලේෂණය සහ ඇලිස් ටිං කණ්ඩායම විසින් සම්පාදනය කර ප්‍රකාශයට පත් කරන ලද දත්ත සමුදායන් භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන් උප සෛලීය දේශීයකරණ විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.ගිනිකඳු සිතියම පර්සියස් වෙතින් ලබා ගන්නා ලදී (v1.6.15.0). ද්වි-පාර්ශ්වික t-පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරමින් සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම සඳහා ප්‍රෝටීන බහුල ගුණය වෙනස්වීම් පරීක්ෂා කරන ලද අතර, ප්‍රෝටීන් පහර බහුල වෙනසක් සමඟින් හඳුනා ගන්නා ලදී >2 (වෙනත් ආකාරයකින් ප්‍රකාශ නොකළහොත්) සහ p අගය <0.05. ද්වි-පාර්ශ්වික t-පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරමින් සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම සඳහා ප්‍රෝටීන බහුල ගුණය වෙනස්වීම් පරීක්ෂා කරන ලද අතර, ප්‍රෝටීන් පහර බහුල වෙනසක් සමඟින් හඳුනා ගන්නා ලදී >2 (වෙනත් ආකාරයකින් ප්‍රකාශ නොකළහොත්) සහ p අගය <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. ප්‍රෝටීන් අන්තර්ගත ගුණක වෙනස්වීම් සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම සඳහා ද්වි-වලිග t-පරීක්ෂණයක් භාවිතයෙන් පරීක්ෂා කරන ලද අතර, ප්‍රෝටීන් ගැළපීම් අන්තර්ගත වෙනස >2 (වෙනත් ආකාරයකින් සටහන් නොකළහොත්) සහ ap අගය <0.05 සමඟ හඳුනා ගන්නා ලදී.使用 双边 t 检验 测试测试使用 双边 ty 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 的 显着性 并 显着性 蛋白质 命 中 中 丰度 丰度 丰度> 2 (另) 2 (另 值) 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. ප්‍රෝටීන් අන්තර්ගතයේ ගුණාකාර වෙනස්වීම්වල සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම වලිග දෙකක t-පරීක්ෂණයක් භාවිතයෙන් පරීක්ෂා කරන ලද අතර, අන්තර්ගත වෙනස්කම් >2 (වෙනත් ආකාරයකින් දක්වා නොමැති නම්) සහ p-අගය <0.05 සඳහා ප්‍රෝටීන ගැලපීම් තීරණය කරන ලදී.String දත්ත ගබඩාව සමඟින් GO විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් ප්‍රෝටීන අන්තර්ක්රියා විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
සමාන ප්රතිඵල සහිතව ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ තුනක් සිදු කරන ලදී.සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය GraphPad Prism (GraphPad මෘදුකාංගය) සමඟ සිදු කරන ලද අතර Perseus (v1.6.15.0) සමඟ ගිනිකඳු බිම් නිර්මාණය කරන ලදී.කණ්ඩායම් දෙක සංසන්දනය කිරීම සඳහා, p-අගය තීරණය කරන ලද්දේ වලිග දෙකක ශිෂ්‍ය ටී-පරීක්ෂණය භාවිතා කරමිනි.පර්යේෂණාත්මක කන්ඩායමේ අවම වශයෙන් දෙවරක්වත් හඳුනාගත් සිංගල්ටන් ප්‍රෝටීන පමණක් ගිනිකඳු බිම්වලට ඇතුළත් කර ඇති අතර, පාලක කණ්ඩායමේ නැතිවූ අගයන් සාමාන්‍ය ව්‍යාප්තියකින් පර්සියස් සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලද අතර එමඟින් p-අගය ගණනය කළ හැකිය.දෝෂ තීරු මධ්යන්ය ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සඳහා ප්‍රෝටෝමික් විශ්ලේෂණ වලදී, අවම වශයෙන් ජීව විද්‍යාත්මක අනුරූ දෙකක පෙනී සිටි ප්‍රෝටීන වල බහුලත්වය රඳවා තබා ඇත.නියැදි ප්‍රමාණය පූර්ව නිර්ණය කිරීම සඳහා සංඛ්‍යානමය ක්‍රම භාවිතා කර නොමැත.අත්හදා බැලීම් අහඹු නොවේ.පර්යේෂකයන් අත්හදා බැලීම් සහ ප්රතිඵල ඇගයීම අතරතුර කර්තව්‍යයන් කෙරෙහි අන්ධ නොවීය.
අධ්‍යයන සැලසුම් පිළිබඳ වැඩි විස්තර සඳහා, මෙම ලිපියට සම්බන්ධ කර ඇති ස්වභාව පර්යේෂණ වාර්තාව සාරාංශය බලන්න.
මෙම අධ්‍යයනයෙන් ලබාගත් ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂ දත්ත දත්ත කට්ටලය ID PXD034811 (PDPL-MS දත්ත කට්ටලය) යටතේ iProX57 හවුල්කාර ගබඩාව හරහා ProteomeXchange Consortium වෙත ඉදිරිපත් කරන ලදී.අමු දත්ත අමු දත්ත ගොනු ආකාරයෙන් සපයනු ලැබේ.මෙම ලිපිය මුල් දත්ත සපයයි.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. අසල්වැසියා දැන හඳුනා ගැනීම: ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ සහ සිතියම් ඉන්ද්‍රියයන් සංලක්ෂිත කිරීමට සමීපත්වය මත යැපෙන biotinylation භාවිතා කිරීම. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. අසල්වැසියා දැන හඳුනා ගැනීම: ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ සහ සිතියම් ඉන්ද්‍රියයන් සංලක්ෂිත කිරීමට සමීපත්වය මත යැපෙන biotinylation භාවිතා කිරීම.Gingras, AS, Abe, KT සහ Raut, B. වටපිටාව පිළිබඳ හුරුපුරුදුකම: ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ සහ සිතියම් ඉන්ද්‍රියයන් සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා සමීපත්වය මත යැපෙන biotinylation භාවිතා කිරීම. Gingras, AC, Abe, KT සහ Raught, B. 了解邻里 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. අසල්වැසි ප්‍රදේශය තේරුම් ගැනීම: ජීව විද්‍යාත්මක ජීවිතය මත අසල්වැසි යැපීම භාවිතා කරන්න.Gingras, AS, Abe, KT සහ Raut, B. සමීපත්වය අවබෝධ කර ගැනීම: ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණවල ගුනාංගීකරනය සහ සමීපත්වය මත යැපෙන biotinylation භාවිතයෙන් අවයව සිතියම්ගත කිරීම.වර්තමාන.මගේ මතය.රසායනික.ජීව විද්යාව 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.ඩෙක්ස්ටර් ශක්තිය ප්රතිශක්තිකරණ සෛල වෙත මාරු කිරීම මගින් ක්ෂුද්ර පරිසරය සිතියම්ගත කිරීම.විද්යාව 367, 1091-1097 (2020).
හර්ට්ලිං, EL et al.ද්වි-ප්‍රෝටියෝම් පරිමාණ ජාලයන් මානව අන්තර්ක්‍රියාවේ සෛල-විශේෂිත ප්‍රතිනිර්මාණය හඳුනා ගනී.සෛල 184, 3022–3040.e3028 (2021).
පසු කාලය: සැප්-15-2022
