පුවත්

Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රවුසර අනුවාදයට සීමිත CSS සහය ඇත.හොඳම අත්දැකීම සඳහා, ඔබ යාවත්කාලීන කළ බ්‍රවුසරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාසිතා සහ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය ලබා දෙන්නෙමු.
පිළිකා සෛල සෛලීය ආතතිය ජය ගැනීමට සහ ඉදිරියට යාමට විවිධ යාන්ත්‍රණ පරිණාමය කර ඇත.ප්‍රෝටීන් kinase R (PKR) සහ එහි ප්‍රෝටීන් සක්‍රියකාරකය (PACT) යනු සෛල ප්‍රගුණනය සහ ඇපොප්ටෝසිස් නිෂේධනයට තුඩු දෙන විවිධ ආතති සංඥා නිරීක්ෂණය කරන මූලික ප්‍රතිචාරකයන් වේ.කෙසේ වෙතත්, පිළිකා සෛල තුළ PACT-PKR මාර්ගය නියාමනය කිරීම බොහෝ දුරට නොදනී.මෙහිදී, දිගු කේතීකරණය නොවන RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR මාර්ගය නිෂේධනය කිරීමට සෘජුවම සම්බන්ධ වන අතර පිළිකා සෛල ප්‍රගුණනය ප්‍රවර්ධනය කරන බව අපට පෙනී ගියේය.CRISPRi 971 පිළිකා ආශ්‍රිත lncRNA හි මහා පරිමාණ ක්‍රියාකාරී පිරික්සීම භාවිතා කරමින්, DARS-AS1 සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි දියුණු කළ පිළිකා සෛල ප්‍රගුණනය සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය.එබැවින්, DARS-AS1 knockout සෛල ප්‍රගුණනය වළක්වන අතර vitro හි විවිධ පිළිකා සෛල රේඛා තුළ පිළිකා සෛල apoptosis ප්‍රවර්ධනය කරන අතර vivo තුළ ගෙඩි වර්ධනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කරයි.යාන්ත්‍රිකව, DARS-AS1 සෘජුවම PACT සක්‍රීය කිරීමේ වසම වෙත බැඳෙන අතර PACT-PKR අන්තර්ක්‍රියා වළක්වයි, එමගින් PKR සක්‍රිය කිරීම, eIF2α පොස්පරීකරණය අඩු කිරීම සහ ඇපොප්ටෝටික් සෛල මියයාම වළක්වයි.සායනිකව, DARS-AS1 බහු පිළිකාවන් තුළ බහුලව ප්‍රකාශ වන අතර, මෙම lncRNA අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම දුර්වල පුරෝකථනයක් පෙන්නුම් කරයි.මෙම අධ්‍යයනය DARS-AS1 lncRNA මගින් PACT-PKR මාර්ගයෙහි පිළිකා-විශේෂිත නියාමනය පැහැදිලි කරන අතර පිළිකා පුරෝකථනය සහ ප්‍රතිකාර සඳහා තවත් ඉලක්කයක් සපයයි.
ආතතියට අනුවර්තනය වීමේ හැකියාව පිළිකා සෛල පැවැත්මේ සහ පැතිරීමේ වැදගත් ලක්ෂණයකි.පිළිකාවේ ශීඝ්‍ර ව්‍යාප්තිය සහ පරිවෘත්තීය ලක්‍ෂණ, දරුණු ක්ෂුද්‍ර පරිසරයක - පෝෂක ඌනතාවය, හයිපොක්සියා සහ අඩු pH අගය - සෛල මරණ සංඥා මාර්ග අවුලුවාලිය හැක.p535, තාප කම්පන ප්‍රෝටීන් 6, 7, KRAS8, 9, සහ HIF-110, 11, 12, 13 වැනි ආතති-සංවේදී ජානවල අක්‍රමිකතා පිළිකා වලදී නිතර නිරීක්ෂණය වන අතර එමඟින් ඇපොප්ටෝසිස් අවහිර කිරීම සහ පැවැත්ම ප්‍රවර්ධනය කරයි.
ප්‍රෝටීන් kinase R (PKR) යනු සෛලීය ආතතිය සෛල මරණයට සම්බන්ධ කරන පරිවර්තන නියාමකයක් වන යුකැරියෝටික් ආරම්භක සාධකය 2α (eIF2α) හි වැදගත් ආතති සංවේදකයක් සහ උප ඒකක කයිනේස් වේ.PKR ප්‍රතිවෛරස් ප්‍රෝටීනයක් ලෙස මුලින්ම හඳුනාගනු ලැබුවේ විදේශීය ද්විත්ව නූල් සහිත RNA (dsRNA) හඳුනාගැනීමෙනි.සක්‍රිය කිරීමෙන් පසු, PKR eIF2α ෆොස්ෆොරයිලේට් වෛරස් සහ සෛලීය ප්‍රෝටීන සංස්ලේෂණය වළක්වයි14,15,16.DSRNA17,18,19,20,21,22,23 නොමැති විට PACT (PKR Activator protein) පළමු PKR සක්‍රියකාරක ප්‍රෝටීනය ලෙස හඳුනාගෙන ඇත.PKR සමඟ සෘජු අන්තර්ක්‍රියා හරහා, PACT විවිධ ආතතීන් (මස්තු සාගින්න, පෙරොක්සයිඩ් හෝ ආසනයිට් ප්‍රතිකාරය) PKR සහ පහළට සංඥා මාර්ග වෙත සම්ප්‍රේෂණය කරයි.eIF2α පොස්පරීකරණයට අමතරව, PACT-මැදිහත් වූ PKR සක්‍රීය කිරීම, PI3K/Akt24 මාර්ගය හරහා වෙනස් කරන ලද රෙඩොක්ස් තත්ත්වය, p5325,26 සහ NF-κB27,28 හරහා වැඩි දියුණු කළ DNA හානි පරීක්ෂා කිරීම සහ NF-κB27,28 නියාමනය කිරීම ඇතුළුව ආතති ප්‍රතිචාරය හා සම්බන්ධ විවිධ සිදුවීම් අවුලුවයි. ආතති ප්‍රතිචාරය, ප්‍රගුණනය, ඇපොප්ටෝසිස් සහ අනෙකුත් ප්‍රධාන සෛලීය ක්‍රියාවලීන්හි ඔවුන්ගේ තීරණාත්මක කාර්යභාරය සැලකිල්ලට ගෙන, PKR සහ PACT බොහෝ රෝග සඳහා, විශේෂයෙන් පිළිකා30,31,32,33 සඳහා ප්‍රතිකාර ඉලක්ක පොරොන්දු වේ.කෙසේ වෙතත්, මෙම ප්ලෙයෝට්‍රොපික් ක්‍රියාකාරී සහ ජීව විද්‍යාත්මක වැදගත්කම තිබියදීත්, පිළිකා සෛල තුළ PACT/PKR ක්‍රියාකාරකම් නියාමනය කිරීම නොපැහැදිලි වේ.
lncRNAs යනු ප්‍රෝටීන්-කේතීකරණ විභවයක් නොමැති නියුක්ලියෝටයිඩ 200කට වඩා විශාල පිටපත් වේ.අති නවීන සමස්ත ජෙනෝම අනුක්‍රමික ව්‍යාපෘති මගින් lncRNA දහස් ගණනක් හඳුනාගෙන ඇති බැවින්, ඒවායේ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් පැහැදිලි කිරීමට බොහෝ උත්සාහයන් දරා ඇත.X-වර්ණදේහ අක්‍රිය කිරීම 38,39, මුද්‍රණය කිරීම, පිටපත් කිරීම41,42, පරිවර්තනය43 සහ පිළිකා වර්ධනය 44,45,46,47 නියාමනය ඇතුළු බොහෝ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාවලීන් සඳහා lncRNA සම්බන්ධ වන බව වර්ධනය වන පර්යේෂණ කණ්ඩායමක් පෙන්වා දී ඇත.මෙම අධ්‍යයනයන් වාර්තා කළේ බොහෝ lncRNAs PACT/PKR මාර්ගයට සම්බන්ධ බවයි.එවැනි එක් අධ්‍යයනයකින් පෙන්නුම් කළේ lncRNA ASPACT PACT පිටපත් කිරීම වළක්වන අතර PACT mRNA හි න්‍යෂ්ටික රඳවා තබා ගැනීම වැඩි කරන බවයි.අනෙකුත් අධ්‍යයනවලින් පෙන්නුම් කර ඇත්තේ lncRNA nc886 PKR සමඟ බන්ධනය වන අතර එහි පොස්පරීකරණය 49,50 වළක්වන බවයි.මෙතෙක්, PACT-මැදිහත් PKR සක්‍රිය කිරීම නියාමනය කරන lncRNA වාර්තා කර නොමැත.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) ඔන්කොජනික් lncRNA51,52,53,54 ලෙස හඳුනාගෙන ඇත.miP-194-5p53, miP-12952 සහ miP-532-3p51 නියාමනය හරහා, DARS-AS1 මගින් පැහැදිලි සෛල වකුගඩු සෛල පිළිකා, තයිරොයිඩ් පිළිකා සහ කුඩා නොවන සෛල පෙනහළු පිළිකා වර්ධනය ප්‍රවර්ධනය කරන බව පෙන්වා දී ඇත.ප්‍රෝටීන් 39 (RBM39) RNA බන්ධන මෝස්තරයේ ස්ථායීතාවය පවත්වා ගැනීමෙන් DARS-AS1 මයිලෝමා ප්‍රගතිය ප්‍රවර්ධනය කරන බව ටොං සහ සගයන් සොයා ගත්හ.කෙසේ වෙතත්, මෙම lncRNA PACT-PKR සක්‍රීය කිරීම සහ පිළිකා සෛලවල ආතති ප්‍රතිචාරය නියාමනය කිරීමට සම්බන්ධ වේද යන්න පිළිබඳව කිසිදු අධ්‍යයනයක් සිදු කර නොමැත.
මෙහිදී, අපි CRISPRi පද්ධතිය භාවිතයෙන් මහා පරිමාණයේ ක්‍රියාකාරීත්වය නැතිවීමේ තිරයක් සිදු කළ අතර DARS-AS1 lncRNA පිළිකා සෛල වර්ග කිහිපයක ව්‍යාප්තිය ප්‍රවර්ධනය කරන බව තීරණය කළෙමු.ඊට අමතරව, අපි ප්‍රධාන යාන්ත්‍රණයක් හඳුනාගෙන ඇත: DARS-AS1 සෘජුවම PACT සමඟ බන්ධනය කරයි, PACT සහ PKR බන්ධනය වළක්වයි, අඩු PKR උපස්ථරයක් වන eIF2α පොස්පරීකරණය වළක්වයි, අවසානයේ ඇපොප්ටෝටික් සෛල මිය යාම වළක්වයි.අවසාන වශයෙන්, අපගේ කාර්යය PACT-PKR මාර්ගයේ නියාමකයෙකු ලෙස DARS-AS1 lncRNA සහ පිළිකා ප්‍රතිකාර සහ පුරෝකථනය සඳහා විභව ඉලක්කයක් ලෙස හෙළි කරයි.
විස්තීරණ ප්‍රවේණික පැතිකඩ අධ්‍යයනයන් මගින් පිළිකා හා සම්බන්ධ lncRNA සිය ගණනක් හඳුනාගෙන ඇත.කෙසේ වෙතත්, ඔවුන්ගේ කාර්යය බොහෝ දුරට නොදන්නා56.පිළිකා ප්‍රගතියට සම්බන්ධ පොරොන්දු වූ lncRNA අපේක්ෂකයින් හඳුනා ගැනීම සඳහා, අපි CRISPRi පද්ධතිය භාවිතයෙන් SW620 කොලරෙක්ටල් පිළිකා සෛල රේඛාවේ ව්‍යාප්තිය අඩු කිරීම සඳහා ක්‍රියාකාරීත්වය නැති කිරීමේ තිරයක් සිදු කළෙමු (රූපය 1a).SW480 සහ SW620 මහා බඩවැලේ පිළිකා සෛල රේඛා වල සුවිශේෂී ලක්ෂණය වන්නේ ඒවා එක් රෝගියෙකු තුළ ඇති ප්‍රාථමික හා ද්විතියික පිළිකා වලින් ව්‍යුත්පන්න වීමයි.උසස් මහා බඩවැලේ පිළිකාවෙහි ප්‍රගතියේ ජානමය වෙනස්කම් අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා මෙය වටිනා සැසඳීමක් සපයයි.එබැවින්, අපි RNA අනුක්‍රමණය භාවිතා කරමින් කොලරෙක්ටල් පිළිකා සෛල රේඛාවල (SW480 සහ SW620) පිටපත් විශ්ලේෂණය කර ප්‍රකාශිත සාහිත්‍යයෙන් විභව ක්‍රියාකාරී lncRNA කිහිපයක් එකතු කළෙමු.මෙම ප්‍රතිඵල මත පදනම්ව, අපි ඍණ පාලනයක් සඳහා පිළිකා ආශ්‍රිත lncRNAs 971ක් සහ ඉලක්ක නොකළ sgRNA oligos 500ක් ඉලක්ක කරගනිමින් 7355 sgRNA oligos අඩංගු සංචිත sgRNA පුස්තකාලයක් නිර්මාණය කළෙමු (පරිපූරක දත්ත 1).
CRISPRi පද්ධතිය භාවිතයෙන් පිරික්සීමේ ක්‍රමානුකූල නිරූපණය.b SgRNA පිරික්සීමෙන් පසු පොහොසත් කිරීම.තිරස් තිත් රේඛාව log2 (fold change) = ±0.58 නියෝජනය කරයි.සිරස් තිත් රේඛාව p අගය = 0.05 පෙන්නුම් කරයි.කළු තිත් ඉලක්ක නොවන sgRNA නියෝජනය කරයි (NC ලෙස නම් කර ඇත).රතු තිත් යනු DARS-AS1 ඉලක්ක කරගත් sgRNA වේ.නිල් තිත් යනු LINC00205 ඉලක්ක කරන sgRNA වේ, කලින් විස්තර කරන ලද ඔන්කොජනික් lncRNA.fold change = (සාමාන්‍ය කියවීම, දින 17)/(සාමාන්‍ය කියවීම, දින 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown සෛල වර්ධනය වළක්වයි.දෝෂ තීරු මගින් අත්හදා බැලීම් තුනේ ± සම්මත අපගමනය නියෝජනය කරයි.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 වලිග දෙකේ සිසුන්ගේ t-පරීක්‍ෂණය.d DARS-AS1 ප්‍රකාශනය පිළිකා වල (TCGA දත්ත කට්ටලය).em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP සහ COAD, පිළිවෙලින් (TCGA දත්ත කට්ටලය) ඇති රෝගීන්ගෙන් යුගල කළ සාමාන්‍ය සහ පිළිකා සාම්පලවල DARS-AS1 ප්‍රකාශනය.p-අගයන් යුගලනය කරන ලද වලිග දෙකේ ශිෂ්‍යයාගේ t-පරීක්‍ෂණය භාවිතයෙන් ලබා ගන්නා ලදී.
ප්ලාස්මිඩය සාදා ලෙන්ටි වයිරසය ඇසුරුම් කිරීමෙන් පසුව, අපි ස්වාධීන ආසාදන පරීක්ෂණ හතරකින් ඉහත පුස්තකාලය සමඟ dCas9-SW620 මහා බඩවැලේ පිළිකා සෛල රේඛාව සම්ප්‍රේෂණය කළෙමු.මෙම ආසාදන සඳහා ආසාදන ගුණත්වය (MOI) 0.1-0.3 ක් වූ අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ සෑම සෛලයක්ම එක් sgRNA සමඟ පමණක් මාරු කළ හැකි බවයි.දින 18ක in vitro සංස්කෘතියෙන් පසුව, ඉලක්කගත sgRNA වල සුපෝෂන පැතිකඩ පිරික්සීමෙන් පසුව අඩු වී හෝ වැඩි වූ අතර, ඉලක්කගත නොවන පාලන ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ සංඛ්‍යාව පූර්ව-පරීක්ෂණ පැතිකඩ හා සසඳන විට සාපේක්ෂව නොවෙනස්ව පැවතුණු අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ අපගේ ඉලක්කය ඉහළ තිර-විශේෂිත බව පෙන්නුම් කරයි. පුස්තකාලය.සහල්.1b සහ පරිපූරක වගුව 1). පෙනහළු පිළිකා සහ අක්මා පිළිකා ප්‍රගතිය 58,59,60 ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා කලින් වාර්තා කරන ලද LINC00205, මෙම පරීක්ෂාවේ විශ්වසනීයත්වය තහවුරු කරමින් (log2 (foldchange) <-0.58, p අගය <0.05) පරීක්ෂා කරන ලදී (රූපය 1b). පෙනහළු පිළිකා සහ අක්මා පිළිකා ප්‍රගතිය 58,59,60 ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා කලින් වාර්තා කරන ලද LINC00205, මෙම පරීක්ෂාවේ විශ්වසනීයත්වය තහවුරු කරමින් (log2 (foldchange) <-0.58, p අගය <0.05) පරීක්ෂා කරන ලදී (රූපය 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, පෙනහළු පිළිකා සහ අක්මා පිළිකා58,59,60 හි ප්‍රගතිය ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා කලින් වාර්තා කර ඇත, (log2 (fold change) <-0.58, p-value <0.05), මෙම පරීක්‍ෂණයේ ශක්තිමත් බව තහවුරු කරමින් (Fig. .1b) . ලින්ක් 5205 之前 之前 报道 可肺癌 ලින්ක් 5205 之前 之前 报道 可肺癌 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, පෙනහළු සහ අක්මා පිළිකා ප්‍රගතිය 58,59,60 ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා කලින් වාර්තා කර ඇත, (log2 (fold change) <-0.58, p-value <0.05), මෙම පරීක්‍ෂණයේ ශක්තිමත් බව තහවුරු කරයි (Fig. .1b).
පරීක්ෂා කරන ලද සියලුම lncRNAs අතර, DARS-AS1 ද තිරගත කරන ලදී, සංජානනීය sgRNA ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ තුන සංස්කෘතියේ දින 18 කට පසුව සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය, මෙම lncRNA තට්ටු කිරීම පිළිකා ව්‍යාප්තිය අඩු කිරීමට හේතු වූ බව යෝජනා කරයි (රූපය 1b).DARS-AS1 knockdown සෛලවල වර්ධන වේගය පාලන සෛල හා සසඳන විට අඩකින් පමණක් අඩු වී ඇති බවත් (Figure 1c) සහ වෙනත් පිළිකා වර්ග කිහිපයක පෙර වාර්තාවලට අනුකූල බවත් පෙන්නුම් කරන MTS විශ්ලේෂණය මගින් මෙම ප්‍රතිඵලය තවදුරටත් සහාය විය.: පැහැදිලි සෛල වකුගඩු පිළිකා, තයිරොයිඩ් පිළිකා සහ කුඩා නොවන සෛල පෙනහළු පිළිකා51,52,53,55.කෙසේ වෙතත්, මහා බඩවැලේ පිළිකා වල එහි ක්‍රියාකාරිත්වය සහ අණුක යාන්ත්‍රණයන් ගවේෂණය කර නොමැත.එමනිසා, අපි වැඩිදුර අධ්‍යයනය සඳහා මෙම lncRNA තෝරා ගත්තෙමු.
රෝගීන් තුළ DARS-AS1 ප්‍රකාශනය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, අපි පිළිකා ජෙනෝම් ඇට්ලස් (TCGA) ව්‍යාපෘතියෙන් පිළිකා සාම්පල 10,327 ක් සවිස්තරාත්මකව විශ්ලේෂණය කළෙමු.අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කරන්නේ මහා බඩවැලේ ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (COAD), වකුගඩු පැහැදිලි සෛල පිළිකා (KIRC) සහ වකුගඩු පැපිලරි සෛල පිළිකා (KIRP) ඇතුළු විවිධ පිළිකාවල නිරෝගී සෛල තුළ DARS-AS1 පුළුල් ලෙස ප්‍රකාශ වී ඇති අතර සැලකිය යුතු ලෙස නියාමනය වී ඇති බවයි..ඉතා ස්වල්පයක් (රූපය 1d සහ පරිපූරක Fig. 1a, b). යුගලනය කරන ලද සෞඛ්‍ය සම්පන්න/ගැටිති සාම්පල විශ්ලේෂණය මගින් මුත්‍රාශයේ මුත්‍රාශයේ පිළිකා (BLCA), වකුගඩු නිරවුල් සෛල පිළිකා (KIRC), පුරස්ථි ග්‍රන්ථි ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (PRAD), පෙනහළු squamous cell carcinoma (LUSC) පිළිකාවල DARS-AS1 සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ප්‍රකාශනයක් තවදුරටත් තහවුරු විය. , ගර්භාෂ කෝපුස් එන්ඩොමෙට්‍රියල් පිළිකා (UCEC), පෙනහළු ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (LUAD), අක්මා හෙපටොසෙලියුලර් පිළිකා (LIHC), වකුගඩු වකුගඩු පැපිලරි සෛල පිළිකා (KIRP), සහ මහා බඩවැලේ ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (COAD) (p අගය <0.05) (රූපය 1e-m) . යුගලනය කරන ලද සෞඛ්‍ය සම්පන්න/ගැටිති සාම්පල විශ්ලේෂණය මගින් මුත්‍රාශයේ මුත්‍රාශයේ පිළිකා (BLCA), වකුගඩු නිරවුල් සෛල පිළිකා (KIRC), පුරස්ථි ග්‍රන්ථි ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (PRAD), පෙනහළු squamous cell carcinoma (LUSC) පිළිකාවල DARS-AS1 සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ප්‍රකාශනයක් තවදුරටත් තහවුරු විය. , ගර්භාෂ කෝපුස් එන්ඩොමෙට්‍රියල් පිළිකා (UCEC), පෙනහළු ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (LUAD), අක්මා හෙපටොසෙලියුලර් පිළිකා (LIHC), වකුගඩු වකුගඩු පැපිලරි සෛල පිළිකා (KIRP), සහ මහා බඩවැලේ ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (COAD) (p අගය <0.05) (රූපය 1e-m) .යුගලනය කරන ලද සෞඛ්‍ය සම්පන්න/ගැටිති සාම්පල විශ්ලේෂණයෙන් මුත්රාශයේ මුත්‍රාශයේ පිළිකා (BLCA), පැහැදිලි සෛල වකුගඩු සහ වකුගඩු සෛල පිළිකා (KIRC), පුරස්ථි ග්‍රන්ථි ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (PRAD), පෙනහළු squamous cell carcinoma (LUSC) පිළිකාවල DARS-AS1 සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ප්‍රකාශනයක් ද තහවුරු විය., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– එම්) . , කෝපුස් ගර්භාෂයේ එන්ඩොමෙට්‍රියල් පිළිකා (UCEC), පෙනහළු වල ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (LUAD), අක්මාවේ හෙපටොසෙලියුලර් පිළිකා (LIHC), වකුගඩු වල පැපිලරි සෛල පිළිකා (KIRP) සහ බඩවැලේ ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (COAD) (p අගය < 0.05) (රූපය 1e- m) .配对 / 肿瘤样本 分析 分析 分析 进一步 进一步 进一步 进一步 进一步 证实 进一步 证实 证实 了 在 在 在 在 在 在 在 膀胱 尿路 上 上 皮癌 皮癌 (blca), 肾 腺腺癌 腺腺癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (praD), 肺鳞状 细胞癌 (LUSC) 肿瘤 的显着 表达 表达 表达 表达 内膜 癌 癌 癌 (ucec), 肺腺癌 (ලුඩ්), 肝肝 细胞癌 细胞癌 (liHc), 肾 肾 细胞癌 和结肠腺癌 (ksp) 和结肠腺癌 (cab) (p 值<0.05）（图1e-m） .配 对 / 肿瘤样本 的 分析 分析 证实 证实 证实 了 证实 在 在 在 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (PRAD), 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的的 中的 中 中中 中中 中中 中中 中中癌 (kirp）) (coad）) (p 值<0.05）) (图1e-m） ) .සෞඛ්‍ය සම්පන්න/ගැටිති යුගල කළ සාම්පල විශ්ලේෂණය මගින් මුත්‍රාශයේ මුත්‍රාශයේ පිළිකා (BLCA), පැහැදිලි සෛල වකුගඩු සෛල පිළිකා (KIRC), පුරස්ථි ග්‍රන්ථි ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (PRAD) සහ පෙනහළු squamous cell carcinoma (LUSC) පිළිකා සඳහා DARS-AS1 භූමිකාව තවදුරටත් සහාය විය.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -එම්). කෝපුස් ගර්භාෂ පිළිකා (UCEC), පෙනහළු ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (LUAD), හෙපටොසෙලියුලර් පිළිකා (LIHC), වකුගඩු පැපිලරි සෛල පිළිකා (KIRP), සහ මහා බඩවැලේ ඇඩිනොකාර්සිනෝමා (COAD) (p අගය <0.05) (රූපය 1e -m) හි ප්‍රකාශනය.එකට ගත් විට, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ DARS-AS1 විවිධ පිළිකාවන් තුළ බහුලව සහ ඉහළ ප්‍රකාශිත බවයි.
DARS-AS1 සහ DARS (Antisense strand කේතනය කරන ජානය) එකම ප්‍රවර්ධකය බෙදා ගන්නා අතර එකිනෙකා අසල පිහිටා ඇති නිසා, අපි SHRNA නිර්මාණය කළේ DARS-AS1 විශේෂයෙන් තට්ටු කිරීමට මිස DARS නොවේ (පරිපූරක Fig. 2a,b සහ අතිරේක වගුව 2 ) .SW620 ට අමතරව, අපි shRNA knockdown හි කාර්යක්ෂමතාව සහ ක්‍රියාකාරිත්වය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා DARS-AS1 ඉහළ ප්‍රකාශනය කරන වෙනත් සෛල රේඛා තුනක් ද භාවිතා කළෙමු (පරිපූරක වගුව 3).අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ සංවර්ධනය කරන ලද shRNA තුනම DARS mRNA ප්‍රමාණයට සුළු බලපෑමක් ඇතිව අවම වශයෙන් 80% DARS-AS1 knockdown කාර්යක්ෂමතාවයක් ලබා ගත් බවයි (පරිපූරක Fig. 2c-f).මීට අමතරව, මෙම shRNAs සමඟ DARS-AS1 knockdown සැලකිය යුතු ලෙස SW620 (49.7%) සහ HCT116 (27.7%), පියයුරු පිළිකා සෛල රේඛාව MBA-MD-231 (53.4%) වල සෛල වර්ධනයට බාධා කරන බව අපට පෙනී ගියේය.) සහ HepG2 හෙපටමා සෛල රේඛාව (92.7% අඩු කිරීම), මෙන්ම නැංගුරම් නොදැමූ ගෝල සෑදීමේ හැකියාව (සාමාන්‍ය අඩු කිරීම ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% සහ 75.7% සෛල රේඛාවකට) (රූපය 2a,b).SW620 හි, යටත් විජිත ගොඩනැගීමේ විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵල තවදුරටත් තහවුරු කළේ DARS-AS1 shRNA මගින් සෛල ප්‍රගුණනය සැලකිය යුතු ලෙස වළක්වන බව දළ වශයෙන් 69.6% ක සාමාන්‍ය අඩුවීමක් සමඟින් (රූපය 2c).
SW620, HCT116, MBA-MD-231, සහ HepG2 සෛලවල සෛල ප්‍රගුණනය (a) සහ ගෝලාකාර සෑදීම (b) මත පාලන shRNA සහ DARS-AS1 shRNA වල බලපෑම.c SW620 සෛල තුළ ජනපද ගොඩනැගීමට පාලන shRNA සහ DARS-AS1 shRNA වල බලපෑම.DARS-AS1 අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන SW620 සෛල වල සෛල ප්‍රගුණනය (d), spheroid සෑදීම (e), සහ යටත් විජිත ගොඩනැගීම (f).පෙන්වා ඇති දත්ත අත්හදා බැලීම් තුනක මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය වේ.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, සහ *** p ≤ 0.001 වලිග දෙකේ ශිෂ්‍ය ටී-පරීක්‍ෂණය මගින්.
ක්‍රියාකාරීත්වය නැතිවීමේ අධ්‍යයනය සම්පූර්ණ කිරීම සඳහා, අපි මීළඟට DARS-AS1 (පරිපූරක Fig. 2g) අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන SW620 සෛල නිර්මාණය කළෙමු.DARS-AS1 අධි ප්‍රකාශනය SW620 සෛලවල සෛල වර්ධනය (1.8 ගුණයකින්), නැංගුරම් නොදැමූ ගෝලාකාර සෑදීම (1.4 ගුණයකින්) සහ යටත් විජිත සෑදීම (3.3 ගුණයකින්) සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි කළේය (රූපය 2d-f).අපි තවත් DARS-AS1 ප්‍රකාශන සෛල රේඛාවක් වන A549 භාවිතයෙන් මෙම ප්‍රතිඵලය තහවුරු කළෙමු.DARS-AS1 අධි ප්‍රකාශනය හේතුවෙන් මෙම වැඩිදියුණු කළ සෛල ප්‍රගුණනය A549 සෛල තුළ තවදුරටත් නිරීක්ෂණය විය (පරිපූරක Fig. 2h, i සහ අතිරේක වගුව 3).එකට ගත් විට, මෙම ලාභ සහ අලාභ අධ්‍යයනයන් පෙන්නුම් කරන්නේ DARS-AS1 මගින් පිළිකා සෛල ප්‍රගුණනය ප්‍රවර්ධනය කරන බවයි.
DARS-AS1 මගින් සෛල ප්‍රගුණනය නියාමනය කරන යටින් පවතින යාන්ත්‍රණය ගවේෂණය කිරීම සඳහා, එහි විභව ප්‍රෝටීන් බන්ධන හවුල්කරුවන් හඳුනා ගැනීම සඳහා අපි RNA පුල්-ඩවුන් විශ්ලේෂණයක් සිදු කළෙමු.RT-qPCR ප්රතිඵල පෙන්නුම් කළේ DARS-AS1 හි 86.2% ක් පමණ SW620 සෛලවල සෛල ප්ලාස්මය තුළ පිහිටා ඇති බවයි (පරිපූරක Fig. 3a).ඉන් විට්‍රෝ ට්‍රාන්ස්ක්‍රයිබ් කරන ලද බයෝටයිනයිලේටඩ් DARS-AS1 හෝ pseudoRNA පසුව SW620 සෛල ලයිසේට් සමඟ ඉන්කියුබේට් කර පසුව SDS-PAGE වෙන් කරනු ලැබේ.පසුකාලීන රිදී පැල්ලම් වලින් පෙන්නුම් කළේ DARS-AS1 ඇදීමේ සාම්පලවල කැපී පෙනෙන කලාපයක් (~38 kDa) සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් වී ඇති නමුත් ව්යාජ RNA හෝ පබළු සාම්පලවල (රූපය 3a) නොවේ.මෙම කලාපය ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (MS) මගින් PKR සක්‍රීය කරන ප්‍රෝටීනයක් (PACT) ලෙස හඳුනාගෙන ඇති අතර SW620, HCT116, සහ HepG2 සෛල රේඛා (Fig. 3a,b) හි ප්‍රතිශක්තිකරණය මගින් තවදුරටත් තහවුරු කරන ලදී.DARS සහ ඒ ආශ්‍රිත PACT ප්‍රෝටීන - PKR සහ TRBP - සුපෝෂණය කිරීම RNA විශ්ලේෂණය මගින් Western blotting (WB) මගින් ද විමර්ශනය කරන ලදී.ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ DARS-AS1 RNA සහ මෙම ප්‍රෝටීන තුන අතර සෘජු අන්තර්ක්‍රියාකාරිත්වයක් නොමැති බවයි (පරිපූරක Fig. 3b).DARS-AS1 සහ PACT අතර නිශ්චිත අන්තර්ක්‍රියා RNA ප්‍රතිශක්තිකරණ (RIP) විශ්ලේෂණය මගින් තවදුරටත් තහවුරු කරන ලදී, එයින් පෙන්නුම් කළේ DARS-AS1 ප්‍රති-PACT ප්‍රතිදේහ වලින් සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් වූ නමුත් වෙනත් පාලන RNA නොවන බවයි (රූපය 3c).වෙනත් සෛලීය සංරචක නොමැති විට DARS-AS1 සෘජුවම PACT සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරයිද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා, පිරිසිදු PACT භාවිතයෙන් in vitro biolayer interferometry (BLI) පරීක්ෂණයක් සිදු කරන ලදී.බයෝටින්-ලේබල් කරන ලද DARS-AS1 හෝ ව්‍යාජ RNA ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් (SA) ජෛව සංවේදක මත නිශ්චල කර පසුව 1 μM PACT අඩංගු චාලක බෆරයේ පුර්වගත කරන ලදී.සැලකිය යුතු ලෙස, PACT DARS-AS1 (KD අගය ~26.9 nM) වෙත තදින් බැඳී ඇත, නමුත් RNA අනුකරණය කිරීමට නොවේ (රූපය 3d).එකට ගත් විට, මෙම ප්‍රතිඵල DARS-AS1 සහ PACT අතර සෘජු අන්තර්ක්‍රියා සහ ඉහළ බැඳීමක් පෙන්නුම් කරයි.
RNA ඇද ගැනීමේ විශ්ලේෂණය DARS-AS1 SW620 සෛල තුළ PACT සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බව හඳුනාගෙන ඇත.ඉහත, අදාළ ප්‍රෝටීන වල රිදී පැල්ලම්.ප්‍රති-PACT ප්‍රතිදේහ සමඟ පහළ ප්‍රතිශක්තිකරණ සිදු කරන ලදී.b RNA පුල්-ඩවුන් විශ්ලේෂණය HCT116 (ඉහළ) සහ HepG2 (පහළ) සෛල තුළ සිදු කරන ලදී.PACT සුපෝෂණය immunoblotting මගින් අනාවරණය විය.cRNA immunoprecipitation (RIP) විශ්ලේෂණයන් SW620 සෛල තුළ සඳහන් කරන ලද ප්‍රතිදේහ භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.d PACT බන්ධන වක්‍ර පූර්ණ-දිග DARS-AS1 හෝ පාලන RNA සඳහා ජෛව ස්ථර අතුරුමිතිය (BLI) භාවිතයෙන් ලබා ගන්නා ලදී.RNA streptavidin biosensor මත නිශ්චල කර ඇත.ආශ්‍රය මැනීමට 1 μM PACT භාවිතා කරන ලදී.e RNA ඇදීමේ විශ්ලේෂණය biotinylated පූර්ණ-දිග DARS-AS1 හෝ කපා දැමූ (ඉහළ) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී.PACT ලැබුණු (පහළ) පෙන්වන Immunoblot.f පවිත්‍ර ධජය සහිත PACT බයෝටයිනයිලේටඩ් පූර්ණ-දිග DARS-AS1 සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන ලද හෝ in vitro RIP විශ්ලේෂණය සඳහා (e හි මෙන්) කපා ඇත.නිස්සාරණය කරන ලද RNA RT-qPCR මගින් තහවුරු කරන ලදී.g PACT සඳහා විවිධ RNA කොටස්වල සාපේක්ෂ සම්බන්ධතාවය ජෛව ස්ථර අන්තර්මිතිය භාවිතයෙන් ලබා ගන්නා ලදී.විශ්ලේෂණය සඳහා, 100 nM RNA සහ 1 μM RAST භාවිතා කරන ලදී.h In vitro RIP පරීක්ෂණ සිදු කරන ලද්දේ පිරිසිදු කරන ලද නොවෙනස්ව හෝ කප්පාදු කරන ලද ලේබල් කරන ලද PACT භාවිතා කරමිනි.නිස්සාරණය කරන ලද RNA RT-qPCR මගින් තහවුරු කරන ලදී.i DARS-AS1, PACT, හෝ දෙකම අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන SW620 සෛලවල වර්ධන වේගය.j SW620 සෛලවල පූර්ණ-දිග හෝ කප්පාදු කරන ලද DARS-AS1 හි අධි ප්‍රකාශනය සෛල වර්ධනයට විවිධ බලපෑම් ඇති කළේය.k ඇපොප්ටෝසිස් ප්‍රති-PARP ප්‍රතිදේහ සමඟ ප්‍රතිශක්තිකරණය මගින් අනාවරණය කර ගන්නා ලදී.l ප්‍රවාහ සයිටෝමෙට්‍රි මගින් පෙන්නුම් කරන පරිදි DARS-AS1 හි තට්ටු කිරීම SW620 සෛලවල ඇපොප්ටෝසිස් ඇති කරයි.පෙන්වා ඇති දත්ත අත්හදා බැලීම් තුනක මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය වේ. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, දෙකේ වලිග සහිත ශිෂ්‍ය ටී පරීක්ෂණයෙන්. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, දෙකේ වලිග සහිත ශිෂ්‍ය ටී පරීක්ෂණයෙන්. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 දෙකේ වලිග සහිත ශිෂ්‍ය ටී-පරීක්‍ෂණය මගින්. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 දෙකේ වලිග සහිත ශිෂ්‍ය ටී-පරීක්‍ෂණය මගින්.
පසුව අපි PACT ආශ්‍රය සඳහා අවශ්‍ය DARS-AS1 කලාපය හඳුනා ගැනීම සඳහා in vitro පිටපත් කිරීම මගින් biotinylated DARS-AS1 RNA කොටස් තුනක් ජනනය කළෙමු (රූපය 3e).RNA විශ්ලේෂණ ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ සෑම ඛණ්ඩයකටම PACT සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කිරීමට හැකි වූ නමුත් 3′-පර්යන්ත කලාපය (A3 ලෙස ලේබල් කරන ලද 384-768 නියුක්ලියෝටයිඩ) A1 ලෙස ලේබල් කරන ලද නියුක්ලියෝටයිඩ 1-384 ට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් පෙන්නුම් කර ඇත (රූපය 3e).ප්‍රතිසංයෝජක PACT (Figure 3f) භාවිතා කරමින් in vitro RIP විශ්ලේෂණයේදී සමාන ප්‍රතිඵල නිරීක්ෂණය විය.මෙම ප්‍රතිඵලවලට අනුකූලව, BLI භාවිතයෙන් නිශ්චල RNA කොටස් PACT වෙත බැඳීමට කරන ලද පරීක්ෂණවලින් පෙන්නුම් කළේ PACT හට A3 (384-768 nt) (KD අගය ආසන්න වශයෙන් 94.6 nM) සඳහා වැඩි බැඳීමක් ඇති බවත්, වෙනත් ප්‍රදේශ සමඟ කිසිදු සම්බන්ධයක් නොමැති බවත්ය.(රූපය 3d).
අපි PACT හි සම්බන්ධිත බන්ධන කලාප ද පරීක්ෂා කළෙමු.PACT හි ක්‍රියාකාරී වසම් තුනක් අඩංගු වන අතර, ඉන් දෙකක් සංරක්ෂණය කර ඇති ද්විත්ව තන්තු සහිත RNA-බන්ධන වසම් (dsRBD) සහ ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා වල සක්‍රියකාරකයක් ලෙස ක්‍රියා කරන තුන්වන වසම (නම් කරන ලද D3) වේ.සෑම වසමකම lncRNA බන්ධන ධාරිතාව පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි එක් එක් වසම් තුනෙන් ඉවත් කර in vitro RIP විශ්ලේෂණයක් සිදු කරන ලද විකෘති තුනක් නිර්මාණය කළෙමු.අපගේ ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කළේ PACT හි තුන්වන වසම (D3) මකාදැමීම DARS-AS1 සමඟ එහි අන්තර්ක්‍රියා සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කර ඇති බවයි (නොනැසී පවතින PACT හා සසඳන විට 0.11 ගුණයකින්) අනෙකුත් විකෘති දෙකට සාපේක්ෂව (රූපය 3h), එය මුදා හැරීම පෙන්නුම් කරන ලදී. D3 හි DARS සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කළේය.-AC1.එකට ගත්විට, මෙම ප්‍රතිඵල යෝජනා කරන්නේ DARS-AS1 සහ PACT අතර අන්තර්ක්‍රියා මූලික වශයෙන් DARS-AS1 හි 3′ අවසානය සහ PACT හි D3 වසම හරහා සිදු විය හැකි බවයි.
PACT ප්‍රකාශනයට DARS-AS1 බලපෑමක් නැති බවත් PACT DARS-AS1 මත කිසිදු බලපෑමක් නොකළ බවත් අපි සටහන් කළෙමු (පරිපූරක Fig. 3c).පසුව අපි සෛල වර්ධනයට PACT knockdown වල බලපෑම පරීක්ෂා කළෙමු.DARS-AS1 ට ප්‍රතිවිරුද්ධව, PACT බිඳ දැමූ විට සාපේක්ෂ සෛල 1.5-3 ගුණයකින් වේගයෙන් වර්ධනය විය (පරිපූරක Fig. 3d).PACT (පරිපූරක Fig. 3e) සමඟ shRNA ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පසු සෛල 2-3 ගුණයකින් යටත් විජිත සෑදී ඇති බව ජනපද පිහිටුවීමේ විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කරයි.DARS-AS1 PACT හරහා සෛල ප්‍රගුණනය නියාමනය කරන්නේ දැයි පරීක්ෂා කිරීමට, අපි PACT, DARS-AS1 හෝ දෙකම අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරමින් SW620 සෛල ජනනය කළෙමු.PACT හි අධි ප්‍රකාශනය මගින් සෛල ප්‍රගුණනය සැලකිය යුතු ලෙස අවහිර කරන ලදී (රූපය 3i).DARS-AS1 අධි ප්‍රකාශනය සෛල ප්‍රගුණනය සැලකිය යුතු ලෙස ප්‍රවර්ධනය කළ අතර, DARS-AS1 සහ PACT අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන සෛලවල වර්ධන වේගයෙහි සැලකිය යුතු වෙනසක් නොතිබුණි.මෙම ප්‍රතිඵල යෝජනා කරන්නේ PACT මගින් DARS-AS1 අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම නිසා ඇති වූ වැඩිවන ව්‍යාප්තියට ප්‍රතිරෝධය දැක්විය හැකි බවයි.
DARS-AS1 හි විවිධ කලාපවලට විවිධ PACT-බන්ධන හැකියාවන් ඇති බැවින්, DARS-AS1 කොටස්වල විවිධ අධි ප්‍රකාශනය මගින් සෛල ප්‍රගුණනය කෙරෙහි ඔවුන්ගේ සාපේක්ෂ බලපෑම අපි විමර්ශනය කළෙමු.අනෙකුත් කොටස් දෙක හා සසඳන විට, DARS-AS1 3′ අන්තයේ (384-768 nt), සෛල ප්‍රගුණනය උත්තේජනය කිරීමේ ඉහළම හැකියාව ඇති DARS-AS1 හි ප්‍රධාන PACT ආශ්‍රිත කලාපය (Fig. 3j) අධික ලෙස පීඩනයට ලක් විය.මෙම ප්‍රතිඵල මගින් DARS-AS1 හි බන්ධන ධාරිතාව සහ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරිත්වය අතර ධනාත්මක සහසම්බන්ධයක් පෙන්නුම් කරයි.
PACT යනු ඇපොප්ටොටික් ගැති ප්‍රෝටීනයක් ලෙස වාර්තා වී ඇත19.එබැවින්, අපි ඇපොප්ටෝසිස් මත DARS-AS1 හි බලපෑම විමර්ශනය කළෙමු.අපේක්ෂා කළ පරිදි, DARS-AS1 knockdown සැලකිය යුතු ලෙස SW620 සෛල තුළ PARP ඛණ්ඩනය වැඩි කළ අතර SW620, HCT116, HepG2, සහ MBA-MD-231 සෛල රේඛාවල ඇනෙක්සින් V-ධනාත්මක සෛල අනුපාතය වැඩි විය (රූපය 3k).3)3f-h), පිළිකා සෛල තුළ DARS-AS1 හි ප්‍රති-ඇපොප්ටෝටික් බලපෑම PACT හි ඇපොප්ටෝසිස් ප්‍රේරක ශ්‍රිතයට ප්‍රතිවිරුද්ධ බව පෙන්නුම් කරයි.එකට ගත්විට, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ DARS-AS1 ඔන්කොජනික් ශ්‍රිතයේ යාන්ත්‍රණය PACT ශ්‍රිතය නිෂේධනය කිරීම හරහා විය හැකි බවයි.
ඊළඟට, අපි DARS-AS1-PACT සංගමයේ ක්‍රියාකාරී ඇඟවුම් ගවේෂණය කළෙමු.PACT සෘජු අන්තර්ක්‍රියා හරහා PKR සක්‍රිය කරන බවට වාර්තා වී ඇති අතර, එය පසුව eIF2α පොස්පරීකරණය වැඩි දියුණු කරයි, පරිවර්තන මකාදැමීම සහ apoptosis17 ඇති කරයි.පළමුව, අපි DARS-AS1 PACT සහ PKR හි සෛලීය ප්‍රාදේශීයකරණයට බලපාන්නේ දැයි පරීක්ෂා කළෙමු.0.72 ක සාමාන්‍ය පියර්සන් සහසම්බන්ධතා සංගුණකයක් සහිත SW620 සෛල තුළ PACT සහ PKR ඉහළ කොලොකලීස් වී ඇති බව කොන්ෆෝකල් ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය පෙන්නුම් කළේය.මේ අතර, DARS-AS1 අධි ප්‍රකාශනය PACT සහ PKR සම-දේශීයකරණය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළේය (මධ්‍යන්‍ය Pearson සහසම්බන්ධතා සංගුණකය 0.61) (රූපය 4a).DARS-AS1 හට PACT-PKR අන්තර්ක්‍රියාව මොඩියුලේට් කළ හැකිද යන්න විමර්ශනය කිරීමට, අපි SW620 සෛල ලයිසේට් වල ප්‍රති-PACT ප්‍රතිදේහ සමඟ සම-ප්‍රතිශක්තිකරණ (co-IP) විශ්ලේෂණයක් සිදු කළෙමු.PKR පාලන සෛලවල ප්‍රති-PACT වලින් පොහොසත් වූ අතර, DARS-AS1 අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන සෛල වලින් ලයිසේට් වල PKR ප්‍රතිසාධනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය (රූපය 4b).පිරිසිදු කරන ලද ලේබල් කරන ලද PACT සහ PKR in vitro ප්‍රෝටීන් බන්ධන පරීක්ෂණ සඳහා භාවිතා කරන ලදී.ඒ අනුව, DARS-AS1 සැපයූ නමුත් පාලන RNA නොමැති ඒවා PACT-PKR අන්තර්ක්‍රියා මර්දනය කරන ලදී (රූපය 4c).සියලුම ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කළේ DARS-AS1 PACT සහ PKR සන්නිවේදනය කඩාකප්පල් කළ බවයි.
කොන්ෆෝකල් ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන් පාලන සෛලවල හෝ DARS-AS1 අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන සෛලවල PACT සහ PKR සම-දේශීයකරණයක් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.න්යෂ්ටීන් DAPI සමඟ පැල්ලම් කර ඇත.ඡායාරූප 16 කින් සංඛ්‍යාලේඛන ප්‍රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී.b Co-immunoprecipitation (co-IP) පාලන SW620 සෛල හෝ DARS-AS1 අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන සෛලවල සෛල ලයිසේට් වල ප්‍රති-PACT ප්‍රතිදේහ භාවිතා කරයි.c ලේබල් කරන ලද PACT, පවිත්‍ර කරන ලද PKR සහ DARS-AS1 හෝ mock RNA සමඟ විට්‍රෝ පිටපත් කරන ලද ප්‍රෝටීන් බන්ධන විශ්ලේෂණය සඳහා ඉන්කියුබේට් කරන ලදී.ප්රතිශක්තිකරණ ප්රතිශක්තිකරණය සඳහා ප්රති-කොඩි ප්රතිදේහ භාවිතා කරන ලදී.d ඇඟවුම් කරන ලද ප්‍රතිදේහ සහිත Immunoblots පාලනය shRNA හෝ DARS-AS1-shRNA සමඟ මාරු කරන ලද SW620 සහ HCT116 සෛල තුළ සිදු කරන ලද අතර පසුව සෙරුමය සාගින්නෙන් පෙළෙන ලදී.e DARS-AS1 ප්‍රකාශන මට්ටම් ටැප්සිගාර්ජින් වෙත සෛලීය සංවේදීතාව වෙනස් කළේය.SW620 සෛල DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid හෝ පාලන ප්ලාස්මිඩ් සමඟ මාරු කරන ලදී.සෛල පැය 48ක් සඳහා ටැප්සිගාර්ජින් සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අතර MTS ප්‍රතික්‍රියාකාරකය භාවිතයෙන් සෛල ශක්‍යතාව තීරණය කරන ලදී.f in vitro transcribed DARS-AS1 හෝ dummy RNA සහ purified PACT in vitro Activation Assay සහ immunoblot හඳුනාගැනීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී.g මෙම ප්‍රතිදේහ භාවිතා කරන Immunoblots SW620-ctrl සෛල (වමේ) හෝ PKR mutants (දකුණේ) අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන සෛල මත සිදු කරන ලදී.මෙම සෛල පසුව පාලනය shRNA හෝ DARS-AS1-shRNA සමඟ මාරු කරන ලද අතර පසුව සෙරුමය සාගින්නෙන් පසුව.h ප්‍රවාහ සයිටෝමිතිය පෙන්නුම් කළේ විකෘති PKR අක්‍රිය කිරීම SW620 සෛල තුළ DARS-AS1-ප්‍රේරිත ඇපොප්ටෝසිස් සඳහා වන්දි ලබා දෙන බවයි.i දක්වන ලද ප්‍රතිදේහ සහිත Immunoblots SW620 (වමේ) හෝ HCT116 (දකුණ) සෛල තුළ සිදු කරන ලදී.පාලන shRNA හෝ DARS-AS1 shRNA සමඟ මාරු කරන ලද සෛල සෙරුමය අහිමි වන අතර 100 nM PKR C16 inhibitor හෝ DMSO සමඟ අතිරේක වේ.පරිමාණ තීරුව = 5 µm.පෙන්වා ඇති දත්ත අත්හදා බැලීම් තුනක මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය වේ.* p ≤ 0.05 වලිග දෙකේ සිසුන්ගේ t-පරීක්‍ෂණය.
PACT PKR17 සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කළ පසු Thr451 හි PKR පොස්පරීකරණය ප්‍රේරණය කළ හැකි බව සාමාන්‍යයෙන් විශ්වාස කෙරේ.අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ සෙරුමය සාගින්නෙන් පසුව DARS-AS1 knockdown සෛල තුළ PKR පොස්පරීකරණයේ මට්ටම සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ගොස් ඇති බවයි (රූපය 4d සහ පරිපූරක Fig. 4a).ඒ අනුව, ප්‍රධාන PKR උපස්ථරය වන eIF2α හි පොස්පරීකරණය ද DARS-AS1 shRNA මගින් සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 4d සහ පරිපූරක Fig. 4a).Thapsigargin යනු ER ආතතිකාරකයක් වන අතර එය ER මගින් Ca2+ මුදා හැරීමට හේතු වේ.ටැප්සිගාර්ජින් සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීම PACT හි ප්‍රකාශනය සහ සක්‍රීය කිරීම ප්‍රේරණය කරන බව වාර්තා වී ඇත, එය PKR සමඟ තවදුරටත් අන්තර් ක්‍රියා කර සක්‍රීය කරයි, eIF2α පොස්පරීකරණය 18,61 වැඩි කිරීමෙන් ඇපොප්ටෝසිස් වලට මග පාදයි.මෙහිදී, PACT/PKR මාර්ගය නිෂේධනය කිරීමෙන් සෛල ආතතිය ජය ගැනීමට DARS-AS1 උපකාර කළ හැකිද යන්න විමර්ශනය කිරීමට අපි PACT/PKR මාර්ගයේ උත්තේජකයක් ලෙස thapsigargin භාවිතා කළෙමු.DARS-AS1 ප්‍රකාශනයේ මට්ටම ටැප්සිගාර්ජින් වලට සෛල ප්‍රතිරෝධය සමඟ ධනාත්මකව සම්බන්ධ වී ඇති බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.DARS-AS1 අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන SW620 සෛල thapsigargin සමඟ ප්‍රතිකාර කළ විට වඩා හොඳින් ගැලවී ගිය අතර DARS-AS1 knockdown සහිත සෛල වඩාත් සංවේදී විය (රූපය 4e).මෙම ප්‍රතිඵලවලට අනුකූලව, DARS-AS1 අධි ප්‍රකාශනය thapsigargin-induced PKR phosphorylation අඩු කළේය (පරිපූරක Fig. 4b).ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, තැප්සිගාර්ජින් ප්‍රතිකාරයෙන් පසුව, පාලන සෛලවලට සාපේක්ෂව PKR සහ eIF2α DARS-AS1 knockdown සෛල තුළ වැඩි ප්‍රමාණයකට පොස්පරීකරණය කරන ලදී (පරිපූරක Fig. 4b).සිත්ගන්නා කරුණ නම්, ටැප්සිගාර්ජින් DARS-AS1 ප්‍රකාශනය ප්‍රේරිත මාත්‍රාව මත යැපෙන ආකාරයෙන්, එය DARS-AS1 හි ප්‍රති-ආතති ක්‍රියාකාරිත්වයක් පෙන්නුම් කරයි (පරිපූරක Fig. 4c).මීට අමතරව, මෙම නිරීක්ෂණ තහවුරු කිරීම සඳහා අපි in vitro Activation assays සිදු කළෙමු.කෙටියෙන් කිවහොත්, PKR ප්‍රති-PKR ප්‍රතිදේහයක් භාවිතයෙන් සෛල ලයිසේට් වලින් පිරිපහදු කරන ලද අතර, පසුව ප්‍රතිසංයෝජක PACT සහ DARS-AS1 මගින් vitro පිටපත් කරන ලදී.එන්සයිම ප්රතික්රියාවෙන් පසුව, ෆොස්ෆෝ-පීකේආර් ඩබ්ලිව්බී භාවිතයෙන් අනාවරණය විය.අපගේ ප්‍රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කළේ PKR පොස්පරීකරණය DARS-AS1 මගින් සැලකිය යුතු ලෙස නිෂේධනය කර ඇති නමුත් පාලන RNA මගින් නොවන බවයි (රූපය 4f).මෙම in vitro සහ in vivo ප්‍රතිඵල යෝජනා කරන්නේ DARS-AS1 PACT-මැදිහත් PKR සක්‍රිය කිරීම වළක්වන බවයි.ඒ අතරම, DARS-AS1 (Figure 4f) ඉදිරියේ PACT ප්‍රතිසාධනයේ අඩුවීමක් ද අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු.මෙම ප්‍රතිඵලය in vitro ප්‍රෝටීන් බන්ධන විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵලවලට අනුරූප වන අතර (Figure 4c) සහ PACT-PKR සංගමය සඳහා DARS-AS1 හි අවහිර කිරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වය නැවත විදහා දක්වයි.
PACT හි D3 වසමේ Ser246 සහ Ser287 සෛලීය ආතතිය යටතේ PKR සක්‍රිය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය වේ.ඇලනීන් සඳහා සෙරීන් අපද්‍රව්‍ය දෙකක් ආදේශ කිරීමෙන් විකෘති PACT (mutD) ලබා දුන් අතර එය ආතතිය නොමැති විට PKR සක්‍රීය කළ අතර ඇලනීන් (mutA) සඳහා ආදේශ කිරීම ප්‍රොටෝකෝලය ආපසු හැරවිය.අපි DARS-AS1 සමඟ සෘජුව සම්බන්ධ වී මෙම වසමේ වැදගත්කම පෙන්නුම් කර ඇති බැවින්, මෙම අපද්‍රව්‍ය DARS-AS1 සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කිරීමට ද සම්බන්ධ විය හැකිද යන්න පරීක්ෂා කිරීමට අපි මෙම PACT විකෘති දෙක උත්පාදනය කළෙමු.සිත්ගන්නා කරුණ නම්, විකෘති දෙපළටම DARS-AS1 (පරිපූරක Fig. 4d) වෙත බැඳීමේ හැකියාව අහිමි වීම, DARS-AS1 සමඟ කාර්යක්ෂම අන්තර්ක්‍රියා සඳහා PACT ප්‍රෝටීනයේ සම්පූර්ණ ව්‍යුහය අවශ්‍ය විය හැකි බව යෝජනා කරයි.
තවද, අපගේ ප්‍රතිපල ද යෝජනා කරන්නේ ප්‍රමුඛ සෘණ PACT mutant (PACTmutA) හෝ අධිපති සෘණ PKR mutant (PKRmut) (PKRmut) (පරිපූරක Fig. 4e. e) අධික ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම මගින් DARS-AS1-shRNA-ප්‍රේරිත සෛල ප්‍රගුණනය නිෂේධනය අර්ධ වශයෙන් ප්‍රතිසාධනය කළ හැකි බවයි.ආධිපත්‍ය-සෘණ PKR විකෘතිවල අධික ප්‍රකාශනය DARS-AS1 knockdown මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද PKR පොස්පරීකරණය මෙන්ම සෙරුමය අහිමි වූ සෛලවල eIF2α පොස්පරීකරණය අඩු කළේය (රූපය 4g).වඩාත් වැදගත් ලෙස, DARS-AS1 knockdown මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද apoptotic සෛලවල අනුපාතය PKRmut අධික ලෙස ප්‍රකාශ කරන සෛල තුළද අඩු විය (රූපය 4h සහ පරිපූරක Fig. 4g).PKR kinase ක්‍රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කිරීම DARS-AS1 ක්‍රියාකාරිත්වය අඩාල කරයි, ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කළේ PKR-විශේෂිත C16 නිෂේධකයක් සමඟ සෛල ප්‍රතිකාර කළ විට DARS-AS1 knockdown කලාතුරකින් PKR සහ eIF2α ෆොස්ෆොරයිලේෂන් අවුලුවාලන බවයි (රූපය 4i සහ අතිරේක Fig. 4h).)එකට ගත් විට, අපගේ ප්‍රතිඵල යෝජනා කරන්නේ DARS-AS1 PACT-මැදිහත් PKR සක්‍රිය කිරීම වැලැක්වීම මගින් අවම වශයෙන් අර්ධ වශයෙන් සෛල ප්‍රගුණනය ප්‍රවර්ධනය කරන බවයි.
Tumorigenesis හි DARS-AS1 හි කාර්යභාරය තවදුරටත් ගවේෂණය කිරීම සඳහා, අපි mouse xenograft ආකෘතියක් භාවිතයෙන් vivo පරීක්ෂණ සිදු කළෙමු. ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ DARS-AS1 තට්ටු කිරීම මීයන්ගේ ගෙඩි වර්ධනය නාටකාකාර ලෙස අඩු වූ බවයි (p අගය <0.0001) (රූපය 5a). ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ DARS-AS1 තට්ටු කිරීම මීයන්ගේ ගෙඩි වර්ධනය නාටකාකාර ලෙස අඩු වූ බවයි (p අගය <0.0001) (රූපය 5a). Результаты показываут, что нокдаун DARS-AS1 REZCO снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ DARS-AS1 knockdown මගින් මීයන්ගේ ගෙඩි වර්ධනය දැඩි ලෙස අඩු කරන බවයි (p අගය <0.0001) (Figure 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001））（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение 10,000). ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී ගියේ DARS-AS1 knockdown මීයන් තුළ ගෙඩි වර්ධනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළ බවයි (p අගය <0.0001) (Figure 5a).මේ අනුව, DARS-AS1 knockdown කාණ්ඩයේ, මධ්‍යන්‍ය පිළිකා පරිමාවේ සැලකිය යුතු අඩුවීමක් 72.9% කින් සහ මධ්‍යන්‍ය පිළිකා ස්කන්ධය 87.8% කින් පමණ අඩු විය (Figure 5b-d).මෙම ප්‍රතිඵල තරයේ යෝජනා කරන්නේ DARS-AS1 මගින් vivo තුළ පිළිකා වර්ධනය සැලකිය යුතු ලෙස ප්‍රවර්ධනය කළ හැකි බවයි.
නිරුවත් මීයන්ගේ කොලරෙක්ටල් ඔන්කොජෙනිසිස් මත දැන්වීම් DARS-AS1 තට්ටු කිරීමේ බලපෑම්.වර්ධන වක්‍ර (a), ගෙඩියේ ප්‍රමාණය (b), බර (c) සහ පිළිකා රූප (d) පෙන්වා ඇත.දෝෂ තීරු ± SEM නියෝජනය කරයි. n = 10. ****p <0.0001, දෙකේ වලිග සහිත සිසුන්ගේ t පරීක්ෂණය මගින්. n = 10. ****p <0.0001, දෙකේ වලිග සහිත සිසුන්ගේ t පරීක්ෂණය මගින්. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 වලිග දෙකේ සිසුන්ගේ t-පරීක්‍ෂණය.n = 10. ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001,通过双尾学生t检验。 ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 වලිග දෙකේ ශිෂ්‍යයාගේ ටී-පරීක්‍ෂණය.e Kaplan-Meier DARS-AS1 ප්‍රකාශන මට්ටම් සහ UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM සහ LGG රෝගීන්ගේ සමස්ත පැවැත්ම අතර සහසම්බන්ධය විශ්ලේෂණය කළේය.රෝගීන්ගේ DARS-AS1 ප්‍රකාශනයේ ඉහළ මට්ටම් ඉහළම 50% අතර විය;රෝගීන්ගේ DARS-AS1 ප්‍රකාශනයේ අඩු මට්ටම 50% ට පහළින් විය.ලොග් ශ්‍රේණිගත කිරීමේ පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් p-අගය තීරණය කරන ලදී.f DARS-AS1 මගින් PACT-PKR මාර්ගය සහ ගෙඩි වර්ධනය නියාමනය කරන යෝජිත ආකෘතිය.
DARS-AS1 හි සායනික බලපෑම වඩා හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීම සඳහා, අපි එහි ප්‍රකාශනය සහ රෝගියාගේ පැවැත්ම අතර සහසම්බන්ධය පරීක්ෂා කළෙමු.TCGA දත්ත කට්ටලය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන්, ඉහළ DARS-AS1 ප්‍රකාශනය uveal melanoma (UVM), වකුගඩු chromophobia (KICH), වකුගඩු පැපිලරි සෛල පිළිකා (KIRP), mesothelioma (MESO), මල්ටිප්ලෙක්ස් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය.අඩු පැවැත්ම සැලකිය යුතු ලෙස ග්ලියෝබ්ලාස්ටෝමා මෝෆෝසිස් (GBM) සහ අඩු ශ්‍රේණියේ මොළයේ ග්ලියෝමා (LGG) රෝගීන් සමඟ සම්බන්ධ විය (රූපය 5e).මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ DARS-AS1 සායනික පිළිකා ප්‍රගතියෙහි වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කළ හැකි අතර බහු පිළිකා සඳහා විභව අනාවැකි ජෛව සලකුණු කාරකයක් විය හැකි බවයි.
මෙම අධ්‍යයනයේ දී, මහා පරිමාණ CRISPRi ක්‍රියාකාරී පිරික්සීම භාවිතා කරමින්, PACT සහ PKR යන ප්‍රධාන ආතති ප්‍රතිචාරකයන් දෙදෙනෙකු නියාමනය කිරීමෙන් DARS-AS1 lncRNA පිළිකා සෛල ආතතිය ජය ගන්නා බව අපි තීරණය කළෙමු.PACT සමඟ සෘජුව අන්තර්ක්‍රියා කිරීමෙන්, DARS-AS1 විසින් PACT-මැදිහත් PKR සක්‍රිය කිරීම වළක්වන අතර, එමගින් ඇපොප්ටෝටික් සෛල මියයාම වැළැක්වීම සහ සෛල ප්‍රගුණනය ප්‍රවර්ධනය කිරීම (Fig. 5f).DARS-AS1 හි නියාමනය විවිධ පිළිකා වර්ග වල නිරීක්ෂණය වී ඇති අතර, ආතති තත්වයන් යටතේ පිළිකා සෛල පැවැත්ම ප්‍රවර්ධනය කිරීමේ එහි ක්‍රියාකාරිත්වය බහුවිධ පිළිකා සඳහා පුළුල් ලෙස අදාළ විය හැකි බව යෝජනා කරයි.
PACT PKR සක්‍රියකාරක ප්‍රෝටීනයක් ලෙස හඳුනාගෙන ඇති අතර, පිටපත් කිරීම, පරිවර්තනය, ඇපොප්ටෝසිස් සහ අනෙකුත් වැදගත් සෛලීය ක්‍රියාවලීන් නියාමනය කිරීම මගින් ආතති ප්‍රතිචාර සඳහා PACT-මැදිහත් PKR සක්‍රිය කිරීම වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි.දශක ගණනාවක් තිස්සේ, PACT-PKR කඳුරැල්ලේ පිළිකා විශේෂිත නියාමනය තේරුම් ගැනීමට උත්සාහ කර ඇත.මෙහිදී, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් සෛලීය lncRNA DARS-AS1 හරහා පිළිකා සෛල තුළ PACT-PKR නියාමනය කිරීමේ වෙනස් යාන්ත්‍රණයක් අනාවරණය විය, එය PACT සමඟ සෘජුවම බැඳී, PACT-PKR අන්තර්ක්‍රියා අවහිර කරයි, PKR සක්‍රීය කිරීම සහ eIF2α පොස්පරීකරණය වළක්වයි, එමඟින් ආතතියෙන් ඇතිවන ඇපොප්ටෝසිස් සහ ඇපොප්ටෝසිස් වළක්වයි. අවසානයේ පිළිකා පැතිරීම උත්තේජනය කිරීම.සෛල.මෙම සොයාගැනීම පිළිකා පුරෝකථනය සහ චිකිත්සාව සඳහා විභව lncRNA ඉලක්ක වෙත ආලෝකය විහිදුවයි.
අපගේ දත්ත පෙන්නුම් කළේ DARS-AS1 knockdown මගින් පොස්පරීකරණය කරන ලද PKR සහ eIF2α හි සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් සමඟ සෙරුමය සාගින්න සඳහා සෛල සංවේදී කරන බවයි.මෙම ප්‍රතිඵල යෝජනා කරන්නේ DARS-AS1 PACT/PKR ක්‍රියාකාරකම් වලක්වාලීම මගින් දරුණු තත්ව යටතේ පිළිකා සෛල පැවැත්ම ප්‍රවර්ධනය කරන බවයි.ASPACT සහ nc886 වැනි තවත් කේතීකරණය නොවන RNA කිහිපයක්, PACT48 mRNA පහත හෙලීමෙන් හෝ PKR49,50,64 වෙත බන්ධනය කිරීමෙන් ස්වයංක්‍රීය පොස්පරීකරණය නියාමනය කිරීමෙන් PACT/PKR අක්ෂයට සම්බන්ධ වේ.ඔවුන් අතර, DARS-AS1 PACT-PKR සංගමයේ කඩාකප්පල් කරන්නෙකු ලෙස ක්රියා කරයි.මෙම අධ්‍යයනය PACT/PKR අක්ෂ නියාමනය සහ ආතති ප්‍රතිචාර වලදී lncRNA වල කාර්යභාරය පිළිබඳ අපගේ අවබෝධය පොහොසත් කරයි.
PACT හි වෙනම වසම් තුනක් අඩංගු වේ.පළමු dsRBD දෙකෙන් සෑම එකක්ම PACT PKR වෙත ඉහළ බැඳීමක් ලබා ගැනීමට ප්‍රමාණවත් වන අතර තුන්වන වසම (D3) vitro සහ vivo තුළ PKR සක්‍රිය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය වේ.අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කළේ DARS-AS1 මනාප D3 වසම සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බවයි (රූපය 3h).lncRNA හි විශාල ප්‍රමාණය (නියුක්ලියෝටයිඩ 768) අනුව, DARS-AS1 D3 වෙත බන්ධනය වීම DSRBD සහ PKR හි PACT වසම අතර අන්තර්ක්‍රියා භෞතිකව වළක්වන අතර එමඟින් PACT සහ PKR සම්බන්ධය අවහිර කරයි.D3 හි Ser246 සහ Ser287 වෙනුවට ඇලනීන් හෝ ඇස්පාටේට් ආදේශ කළ PACT ලක්ෂ්‍ය විකෘති DARS-AS1 සඳහා එහි බන්ධන බැඳීම කඩාකප්පල් කළ අතර, D3 හි සමස්ත ව්‍යුහාත්මක සහ විද්‍යුත් ගුණාංගවල වැදගත්කම ඔවුන්ගේ ආශ්‍රය තුළ පෙන්වා දෙයි.වඩාත් නිරවද්‍ය ජෛව රසායනික විශ්ලේෂණය සහ ඉහළ විභේදන PACT ව්‍යුහාත්මක විශ්ලේෂණය භාවිතා කරමින් මෙම යාන්ත්‍රණය පිළිබඳ වැඩිදුර විස්තර අනාගතයේදී අවශ්‍ය වනු ඇත.
DARS-AS1 යාන්ත්‍රණ කිහිපයක් හරහා සෛල ප්‍රගුණනය ප්‍රවර්ධනය කරන බව පෙර අධ්‍යයනයන් වාර්තා කර ඇත51,52,53.එක් උදාහරණයක දී, DARS-AS1 වකුගඩු පිළිකා සෛල තුළ miP-194-5p ඉලක්ක කර ගනිමින් එහි ප්‍රතිදේහ ප්‍රෝටීන්-කේතන DARS ජානය නියාමනය කළ බව විමර්ශකයින් නිරීක්ෂණය කළහ.කෙසේ වෙතත්, වර්තමාන අධ්‍යයනයේ දී, DARS-AS1 knockdown අවම වශයෙන් මහා බඩවැලේ, පියයුරු සහ අක්මා පිළිකා ඇතුළු පිළිකා වර්ග කිහිපයක DARS පිටපත් කිරීම කෙරෙහි එතරම් බලපෑමක් කළේ නැත.lncRNAs සෛල හා පටක විශේෂිත ප්‍රකාශන රටා ප්‍රදර්ශනය කරන නිසා, පිළිකා වර්ග හරහා ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණ සංරක්ෂණය නොවිය හැකි අතර, අපගේ නිරීක්ෂණ සහ විවිධ පිළිකා පිළිබඳ පූර්ව තක්සේරු කිරීම් අතර මෙම විෂමතාවයට දායක විය හැක.විවිධ කායික හා ව්යාධි ක්රියාවලීන්ගේ නිශ්චිත යාන්ත්රණයන් පැහැදිලි කිරීම සඳහා විශේෂ අධ්යයන අවශ්ය වේ.
සායනික දත්ත විශ්ලේෂණයකින් පෙන්නුම් කළේ පිළිකා රෝගීන්ගේ පැවැත්ම සමඟ DARS-AS1 ප්‍රකාශනය ප්‍රතිලෝමව සම්බන්ධ වන බවයි, එය පිළිකා පුරෝකථනය කිරීමේදී DARS-AS1/PACT/PKR අක්ෂයේ වැදගත්කම අවධාරණය කරයි.අවසාන වශයෙන්, අපගේ අධ්‍යයනයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ DARS-AS1 යනු PACT/PKR සංඥා අක්ෂයේ නියාමකයෙකු බවත්, පිළිකා සෛල ප්‍රගුණනය ප්‍රවර්ධනය කරන බවත්, ආතති ප්‍රතිචාරය අතරතුර ඇපොප්ටෝසිස් වළක්වන බවත්, එය තවත් පර්යේෂණ මාලාවක් සපයන අතර විභව ප්‍රතිකාර පිළිබඳ අනාගත පර්යේෂණ සඳහා උනන්දුවක් දක්වන බවත්ය. .
මානව සෛල රේඛා SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 සහ HEK293T චීනයේ ජාතික සෛල රේඛා සම්පත් යටිතල ව්‍යුහයෙන් ලබා ගන්නා ලදී.සියලුම සෛල DMEM මාධ්‍යයේ (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) සහ 1% පෙනිසිලින්-ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (Thermo Fisher Scientific) 37°C, 5% CO2 හි නඩත්තු කරන ලදී.ඉන්කියුබේටර්.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));ප්රති-eIF2α (පොස්පරස් S51), Abcam (ab32157);විරෝධී PACT (පොස්පරස් S246), Abgent (AP7744b);ප්රති-β-tubulin, CST (2128);සාමාන්ය මූසිකය IgG, CST (5415S);සාමාන්‍ය හාවා IgG, CST (2729S).ප්‍රතිදේහ බටහිර බ්ලොටින් සඳහා PBST හි 1:1000 සහ IP සඳහා 1:100 තනුක කර ඇත.
sgRNAs වැඩි දියුණු කරන ලද්දේ CRISPR-ERA66 නම් ප්‍රසිද්ධියේ පවතින මෙවලමක් භාවිතා කරමිනි.අපි sgRNA සංවර්ධනය සඳහා පෙරනිමි මෙවලම් පරාමිති සහ 3 kb කලාපයේ ඇල්ගොරිතම ගණනය කළ sgRNA බන්ධන අඩවි භාවිතා කළෙමු.TSS හි කේන්ද්‍රගත කර ඇත.sgRNA ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ තටාක CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) හි සංස්ලේෂණය කරන ලද අතර මානවකරණය කරන ලද pgRNA ප්ලාස්මිඩ (Addgene #44248) බවට ක්ලෝන කරන ලදී.සංචිත කරන ලද මානවකරණය කරන ලද pgRNA ප්ලාස්මිඩ් 12 µg, psPAX2 (Addgene #12260) 7.2 µg, සහ pMD2.G (Addgene #12259) 4.8 µg (Addgene #12259) DNA වලට 5 x 1036 HEK103 ට සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද DNA වලට සම-පරිවර්තනය කරන ලදී. සෛල (CWBIO, බීජිං, චීනය) නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුගමනය කරයි.සම්ප්‍රේෂණය කිරීමෙන් පැය 48 සහ 72 කට පසු වෛරස් අඩංගු අධි ප්‍රවාහ එකතු කර 0.45 µm පෙරහනක් හරහා පෙරීම සිදු කරන ලදී.පිරික්සීම සඳහා, dCas9/KRAB විලයන ප්‍රෝටීනය ප්‍රකාශ කරන SW620 සෛල වෛරස් සම්ප්‍රේෂණය මගින් ලබා ගන්නා ලදී.නවීකරණය කරන ලද SW620 සෛල 0.1-0.3 ක MOI හි ස්වාධීන ආසාදන පරීක්ෂණ හතරක් තුළ වෛරස් පුස්තකාලයට ආසාදනය වී ඇති අතර දින 2 ක් සඳහා 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) සාම්පල ලබා ගන්නා ලදී.ඉන්පසුව, පරීක්ෂා කිරීම සඳහා අවම වශයෙන් සෛල 500/sgRNA පුස්තකාල ආවරණයක් සහිතව, සෛල දින 18ක් vitro තුළ වගා කරන ලදී.
QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) හි උපදෙස් අනුව ජානමය DNA උපුටා ගන්නා ලදී.සමස්තයක් වශයෙන්, පුස්තකාලය ගොඩනැගීම සඳහා ජීව විද්‍යාත්මක පුනරාවර්තනයකට ජානමය DNA 100 μg භාවිතා කරන ලදී.sgRNA කලාපය PCR වට දෙකකින් විස්තාරණය කර තීරු කේතයකට සම්බන්ධ කරන ලදී.
PCR නිෂ්පාදන NucleoSpin® gel සහ PCR පිරිසිදු කිරීමේ කට්ටලය (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) භාවිතයෙන් පිරිසිදු කරන ලද අතර Qubit™ HS ද්විත්ව නූල් DNA හඳුනාගැනීමේ කට්ටලය (Thermo Fisher Scientific; Q32854) භාවිතයෙන් ප්‍රමාණනය කරන ලදී.
සෛල පැතිරීම මැනීම සඳහා MTS විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලදී.සෛල 2000/ළිඳක ආරම්භක ඝනත්වයකින් 96-ළිං තහඩු වල සෛල බීජ කරන ලදී.මුළු දින 4-6 සඳහා නියමිත වේලාවට දිනපතා සෛල සාපේක්ෂ සංඛ්යාව මනිනු ලැබේ.සෑම ළිඳක් සඳහාම, 20 μl MTS ප්‍රතික්‍රියාකාරක (Promega) DMEM 100 μl සමඟ තනුක කර, 37 ° C දී පැය 4 ක් සඳහා සෛල සමඟ ඉන්කියුබ් කර, පසුව OD490 මනිනු ලැබේ.
නැංගුරම් නොදැමූ වර්ධනය සඳහා ඇති හැකියාව සොයාගනු ලැබුවේ ගෝල සෑදීම විශ්ලේෂණය කිරීමෙනි.කෙටියෙන් කිවහොත්, shRNA DARS-AS1 හෝ පාලන shRNA මගින් මාරු කරන ලද සෛල 2000ක් සෑම දින 4කට වරක් මධ්‍යම වෙනසක් සහිතව අතිශය අඩු ඇමුණුම් මයික්‍රොප්ලේට් (Corning) තුළ වගා කරන ලදී.ගෝලාකාර ගණනය කරනු ලැබුවේ දින 14 කට පසුවය.DARS-AS1 අධි පීඩන ප්ලාස්මිඩය හෝ පාලන ප්ලාස්මිඩය සමඟ මාරු කරන ලද සෛල 500 ක් වැඩිදියුණු කිරීමේ තක්සේරුව සඳහා භාවිතා කරන ලදී, එසේ නොමැති නම් ක්‍රමය නොවෙනස් විය.
Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) හි උපදෙස් අනුව T7 RNA පොලිමරේස් සහ biotin-16-UTP (Roche 1138908910) භාවිතයෙන් RNA පිටපත් කර ඇත.මෙහි භාවිතා වන ප්‍රාථමිකයන් පරිපූරක වගුව 4 හි ලැයිස්තුගත කර ඇත.
ප්‍රෝටීන්-කේතීකරණ PACT හෝ PKR කලාප pET15b (Addgene #73619) බවට ක්ලෝන කර BL21(DE3) බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.ඇම්පිසිලින් සමඟ සපයා ඇති LB හි බැක්ටීරියාව එක රැයකින් පුර්වාගත කරන ලද අතර පසුව නැවුම් LB සමඟ 100 ගුණයකින් තනුක කරන ලදී.මාධ්‍යයේ OD600 0.8ට ළඟා වූ විට, ප්‍රෝටීන් ප්‍රකාශනය ඇති කිරීම සඳහා 1 mM IPTG එකතු කරන ලදී.මෘදු සෙලවීමකින් (20 ° C දී 250 rpm) එක රැයකින් පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසුව, සෛල පෙති කේන්ද්‍රාපසාරී (4000 rpm, 10 min, 4 ° C) මගින් එකතු කරන ලදී.ලයිසිස් බෆරයේ සෛල පෙති නැවත සවි කරන්න (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) සහ අයිස් මත විනාඩි 30 ක් පුර්වාගත කරන්න, ඉන්පසු සොනිකේට් (විනාඩි 15, තත්පර 5 ක් ක්‍රියාත්මක/අක්‍රිය, අයිස් මත) සහ කේන්ද්‍රාපසාරී (13,000) rpm)., විනාඩි 30, 4 ° С).ඉන්පසුව අධි ප්‍රනාටකය Ni-NTA දුම්මල (QIAGEN) මතට 4°C ට 3 වතාවක් පටවා, වොෂ් බෆරයෙන් 4 වරක් සෝදා (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) සහ 3 වතාවක්, සම්පූර්ණයෙන් ඉවත් කරන ලදී. මිලිලීටර් 10ක් එලියුන්ට් බෆරය (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).WB භාවිතයෙන් පිරිසිදු කරන ලද ප්‍රෝටීන් නිර්ණය කරන ලද අතර Qubit™ ප්‍රෝටීන් විශ්ලේෂණ කට්ටලය (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) භාවිතයෙන් සාන්ද්‍රණය තීරණය කරන ලදී.
කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි වෙනස් කිරීම් සහිතව RIP පරීක්ෂණ සිදු කරන ලදී.කෙටියෙන්, 1x RIP බෆරය (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, cotail101 ප්‍රෝටේටේස් 07) (Roche, 1 mM DTT) සහ 4 °C දී විනාඩි 15 ක් සඳහා 13,000 rpm දී කේන්ද්රාපසාරී.අධි ප්‍රතිදේහ 5 μg ප්‍රති-PACT ප්‍රතිදේහ (Abeam) හෝ IgG (CST) සමඟ සංකලනය වූ ප්‍රෝටීන් A+G චුම්බක පබළු (Millipore) සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන ලදී.පබළු 5x RIP බෆරයකින් 5 වතාවක් සෝදා, පසුව ප්‍රෝටීනේස් K (NEB) සමඟ දිරවන ලදී.RNA ට්‍රයිසෝල් සමඟ නිස්සාරණය කර RT-qPCR මගින් තීරණය කරන ලදී.ප්‍රයිමර් පරිපූරක වගුව 5 හි ඉදිරිපත් කර ඇත.
නවීකරණය කරන ලද සම්මත RIP පරීක්ෂණ ප්‍රොටෝකෝලයකට අනුව in vitro RIP විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.5 pmol in vitro transcribed RNA RIP බෆරය සමඟ 1x තනුක කර විනාඩි 5ක් සඳහා 65 ° C දී ඉන්කියුබේෂන් මගින් ඇනීල් කර කාමර උෂ්ණත්වයට සෙමින් සිසිලනය කරන ලදී.E. coli වලින් 5 pmol නොවෙනස්ව හෝ විකෘති ධජ ලේබල් කරන ලද PACT ප්‍රෝටීන පිරිසිදු කරන ලදී.ප්‍රතිනිර්මාණය කරන ලද RNA සමඟ 4°C දී පැය 2ක් පුර්වාගත කරන්න සහ ප්‍රති-ධජ IP සඳහා RIP විශ්ලේෂණය සඳහා ඉහත ක්‍රියා පටිපාටිය අනුගමනය කරන්න.
RNA දිගු විශ්ලේෂණය සඳහා, 1xRIP බෆරය සමඟ 1×107 සෛල ලයිස් කරන ලදී.4 ° C දී විනාඩි 15 ක් සඳහා 13,000 rpm දී කේන්ද්රාපසාරී කිරීමෙන් පසුව, 4 ° C දී පැය 2 ක් සඳහා ස්ට්රෙප්ටාවිඩින් චුම්බක පබළු (බෙක්මන්) 30 μl සමඟ අධි ප්රෝඩාව පෙරනිමිති.පසුව පිරිසිදු කරන ලද ලයිසේට් යීස්ට් tRNA සමඟ සපයා නැවත සකස් කරන ලද RNA 40 pmol සමඟ රාත්‍රියේ 4 ° C දී පුර්වීකරණය කරන ලදී, පසුව තවත් පැය 2 ක් සහ BSA සමඟ අවහිර කරන ලද නව ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් චුම්බක පබළු 20 μl එකතු කරන ලදී.සේදීමේ පියවර 5x RIP බෆරය සමඟ 4 වතාවක් සහ 1x RIP බෆරය සමඟ 4 වතාවක් සමන්විත විය.අනුරූපී ප්‍රෝටීන biotin elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) සමඟින් ඉවත් කර NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) මත වෙන් කරන ලදී.රිදී වර්ණ ගැන්වීමෙන් පසුව (Beyotime Biotechnology), MS විසින් ඇතැම් පටි ඉවත් කර විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
PACT සහ PKR අතර අන්තර්ක්‍රියා පරීක්ෂා කිරීම සඳහා Co-IP විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.කෙටියෙන් කිවහොත්, 1 x RIP බෆරයක 1 x 107 ලයිස්ඩ් සෛල පුර්වීකරණය කිරීමෙන් සුපර්නැටන්ට් ලයිසේට් සකස් කරන ලද අතර පසුව 13,000 rpm දී විනාඩි 15ක් 4 ° C දී කේන්ද්‍රාපසාරී කර ඇත.ලයිසේට් ප්‍රෝටීන් A + G චුම්බක පබළු වලින් පටවා, ප්‍රති-PACT ප්‍රතිදේහ 5 µg සමඟ ඒකාබද්ධ කර, 4 ° C දී එක රැයකින් මෘදු ලෙස භ්‍රමණය විය.පබළු 3 වතාවක් 5×RIP බෆරයකින් ද, දෙවරක් 1×RIP බෆරයකින් ද 1×SDS බෆරයකින් ද සෝදා හරින ලදී.ප්‍රතිසාධන ප්‍රෝටීනය SDS-PAGE ජෙල් මගින් විශ්ලේෂණය කර WB විසින් අනාවරණය කර ගන්නා ලදී.
ධජය සහිත PACT හි pmol දෙකක් සහ PKR හි 1 pmol E. coli වලින් පිරිසිදු කරන ලදී.1× RIP බෆරයක තනුක කර නැවත සකස් කරන ලද RNA 10 pmol සමඟ 4 °C දී පැය 2 ක් පුර්ව තනන්න.ඊට පසු, ඒවා ප්‍රෝටීන් A+G චුම්බක පබළු-සංයෝජන ප්‍රති-ලේබල් කරන ලද ප්‍රතිදේහ සමඟ අමතර පැය දෙකක් සඳහා පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කරන ලදී.පසුව පබළු 1x RIP බෆරයකින් හතර වතාවක් සෝදා 1x SDS බෆරයකින් ඉවත් කරන ලදී.ප්රතිඵලයක් වශයෙන් PACT සහ PKR WB විසින් අනාවරණය කර ගන්නා ලදී.